人類只能與病毒“相殺”？

李慶超

病毒是導致人類疾病的一類重要病原體。早在還不知道什么是病毒的時候，人類就已經(jīng)想方設(shè)法對付病毒了。

中國人明朝就開始使用人痘預防天花，1798年，英國醫(yī)生詹納發(fā)明了使用牛痘作為疫苗預防天花的方法；1885年，法國科學家巴斯德發(fā)明了狂犬病疫苗；1892年人類發(fā)現(xiàn)了第一種病毒——煙草花葉病毒，這種病毒比細菌小，能讓植物生病；1898年發(fā)現(xiàn)了首個動物病毒——感染牛羊的口蹄疫病毒；1901年發(fā)現(xiàn)了首個人類病毒——通過蚊子傳播的黃熱病病毒；1911年發(fā)現(xiàn)了可以導致雞腫瘤的勞氏肉瘤病毒（圖1）。

后來，人們對病毒的認識越來越深刻，病毒研究成為一門單獨的學科：病毒學（圖2）和一般人想象的不同，病毒學研究除了回答基礎(chǔ)的科學問題、預防和治療病毒病之外，還涉及開發(fā)和利用病毒。而這三種功能都離不開最重要的病毒研究工具：反向遺傳操作系統(tǒng)。這一系統(tǒng)，可以說是病毒學家的“毒門秘籍”了。

一、病毒檢測

病毒學研究的第一步是病毒檢測。

已知病毒的檢測，主要應(yīng)用于醫(yī)學診斷和流行病學調(diào)查，采用的檢測方法主要有癥狀診斷、免疫學檢測、核酸檢測以及一些凝血實驗等特異性反應(yīng)的檢測。

對于未知病毒，則需要通過分離、培養(yǎng)、鑒定的過程去發(fā)現(xiàn)，最后可以通過電子顯微鏡來直接觀察病毒。但最終要通過測序的手段拿到病毒的基因組序列。這是因為，病毒的基因組序列是其最核心的組分，抓住了病毒的基因組序列，就等于找到了病毒。

今天的科技迅猛發(fā)展，科研人員采用深度測序技術(shù)（圖3），很容易就能發(fā)現(xiàn)大量新的病毒。對于疑似感染未知病原體的病人，我們可以在恰當?shù)牟课徊蓸樱崛『怂?，?gòu)建文庫，并進行深度測序。測序之后，通過生物信息的方法尋找其中的病原體序列，并給出鑒定結(jié)果。

二、放大招：“毒”門秘籍

找到病毒之后接下來怎么開展研究呢？接下來，我們就來介紹病毒學家所使用的最重要的研究工具：反向遺傳操作系統(tǒng)。

1.遺傳學及反向遺傳學

為了了解反向遺傳學，需要先了解一下遺傳學。觀察生物體，我們可以發(fā)現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)、功能方面的特征，比方說頭發(fā)、皮膚、瞳孔的顏色，這些稱之為表現(xiàn)型，也叫表型。表現(xiàn)型是由生物體的基因組所決定的，而生物個體的全部基因組合就總稱為基因型（圖4）?；蛐蜎Q定了表型，而表型反映了基因型。

一開始，人們并不知道遺傳的本質(zhì)，因此最初是從表型出發(fā)來研究遺傳學的相關(guān)問題的。孟德爾使用豌豆、摩爾根使用果蠅來研究遺傳學，他們通過豌豆的紅花、白花或者說果蠅的紅眼、白眼這種表型來尋找遺傳規(guī)律，并定位表型相關(guān)的基因。因此，經(jīng)典的遺傳學是從表型出發(fā)來研究基因型的，這就是正向遺傳學。

在正向遺傳學中，需要通過自然突變或誘變的方式，篩選具有特殊表型的突變體，然后再定位是哪個基因決定了這個表型，并且研究該基因的功能。

在反向遺傳學中，科學家拿到一個未知的基因，可以主動對這個基因進行突變或者改變它的表達量，再去觀察基因突變或基因表達量的變化引起了什么樣的表型變化，并與野生型（沒有經(jīng)過人為改變的正?；蛐停┑谋硇瓦M行比較，從而推測基因的功能。因此，反向遺傳學是通過改變基因型，觀察表型改變的結(jié)果，來研究基因的功能（圖5）。

2.反向遺傳學的必備條件是基因工程技術(shù)

根據(jù)概念，我們不難看出，反向遺傳學中，需要對特定的核酸序列進行改造，而這種改造的技術(shù)，實際上是我們認識了DNA這種遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)展了多種基因工程工具酶或者基因工程手段之后，才得以實現(xiàn)的?；蚬こ淌抢蒙锛夹g(shù)對生物體基因進行直接操縱的、改變細胞的遺傳組成的技術(shù)。因此反向遺傳學的思路，要比經(jīng)典遺傳學的思路出現(xiàn)得晚。

DNA是細胞生物的遺傳物質(zhì)，它比RNA要穩(wěn)定，而且大多數(shù)基因工程的工具酶作用對象是DNA，因此遺傳物質(zhì)的改造主要是在DNA上進行的。我們進行遺傳物質(zhì)改造，主要是在質(zhì)粒（圖6）上完成的，因為質(zhì)粒是一種基因組外的、可以獨立復制的游離DNA，其擴增比較方便，可以在細菌或酵母中進行。

3.感染性克隆

病毒的基因組通常比較小，因此我們可以把病毒基因組的雙鏈接DNA副本組裝在質(zhì)粒中。把這些帶有病毒序列的質(zhì)粒DNA，或者由質(zhì)粒指導轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA送進細胞——這個過程叫做“轉(zhuǎn)染”——可以指導細胞工廠產(chǎn)生病毒蛋白，復制新的病毒基因組，并組裝釋放，產(chǎn)生感染性病毒顆粒。

病毒的基因組可以是DNA，也可以是RNA。DNA病毒的基因組可以擴增、切割之后直接連入質(zhì)粒；而RNA病毒的基因組，則需要通過RNA指導合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程，轉(zhuǎn)化成DNA之后，再連入質(zhì)粒。這些攜帶有病毒基因組序列、可以產(chǎn)生感染性病毒顆粒的質(zhì)粒，就稱作“感染性克隆”。將構(gòu)建好的感染性克隆轉(zhuǎn)染到細胞中，或轉(zhuǎn)錄成RNA之后轉(zhuǎn)染細胞，就可以產(chǎn)生新的病毒（圖7）。

4.反向遺傳操作系統(tǒng)

前面講到，反向遺傳研究的思路就是改變基因序列，從基因型出發(fā)研究表型，進而研究基因功能。對病毒也是一樣：構(gòu)建感染性克隆，對其進行基因工程改造，將改造后的感染性克隆轉(zhuǎn)入細胞中，就能產(chǎn)生帶有突變的病毒，然后用這些新的病毒去感染細胞或宿主，觀察病毒的復制、宿主的癥狀等表型，就可以研究病毒相關(guān)基因的功能（圖8）。這樣一套系統(tǒng)，我們稱之為病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)。

以最近發(fā)布的新冠病毒反向遺傳操作系統(tǒng)為例：它是借助酵母獲得感染性克隆的。首先，新冠病毒基因組RNA通過逆轉(zhuǎn)錄及擴增獲得DNA片段，或者直接合成病毒的DNA版本，然后在酵母中重組合成感染性克隆質(zhì)粒，提取質(zhì)粒之后，轉(zhuǎn)錄合成RNA，RNA轉(zhuǎn)染細胞之后，就可以產(chǎn)生新冠病毒了（圖9）。

不論是用于研究，還是用于疫苗或者治療，要制作病毒，我們都需要在質(zhì)粒上進行改造，改造的過程中，就會借助一些酶切位點、篩選標記、以及必要的質(zhì)粒片段等基因工程工具。

同時，我們的病毒序列是從天然的病毒中獲取的，設(shè)計和制造感染性克隆過程中，勢必會沿用現(xiàn)有的理論模型以及設(shè)計思路，即便是從頭開始人工合成一個新的病毒，也會在密碼子使用頻率等等方面，留下人工痕跡。因此，一個病毒是否是人工合成的，是很容易鑒定出來的。

三、病毒學研究的應(yīng)用

病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，是病毒學以及相關(guān)生命科學領(lǐng)域中非常重要的工具，它可以用于基礎(chǔ)研究，研究病毒中各個基因的功能，也可以用于疫苗開發(fā)，還可以將病毒作為載體，裝載上不同的基因序列，用于其他生命科學研究。此外，隨著生命科學的發(fā)展，病毒載體用于細胞治療、基因治療以及癌癥治療的前景也越來越光明。

1. 基礎(chǔ)研究應(yīng)用

病毒學的思路及工具在生物學基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。目前病毒載體廣泛應(yīng)用于基因的過表達、敲除、敲低、動物模型改造等各個方面。以病毒學研究中的假病毒應(yīng)用為例（圖10）：我們可以使用反向遺傳操作系統(tǒng)的基本方法制作假病毒顆粒，令假病毒顆粒包膜上含有所研究病毒的包膜蛋白，可以用來模擬病毒顆粒的抗原性、被中和及感染早期過程。

但是，顆粒內(nèi)部僅含有缺陷病毒基因組或沒有基因組，因此假病毒不能完成病毒的復制周期，也就不會讓宿主發(fā)病。由于安全性比較好，借助假病毒顆粒，我們就可以在生物安全級別相對較低的實驗室內(nèi)研究一些危險的病毒。

2.疫苗研發(fā)和生產(chǎn)

我們每個人都打過疫苗，大家可以摸一摸自己胳膊上的疤痕，那是注射卡介苗留下來的。疫苗通過刺激機體產(chǎn)生獲得性免疫保護，從而預防疾病。根據(jù)疫苗的組分，可以分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、類毒素、亞單位疫苗、重組蛋白或多肽疫苗，以及病毒載體疫苗、DNA或RNA疫苗等。

疫苗需要同時滿足兩個條件：既能刺激機體產(chǎn)生有效的免疫保護，又要不導致疾病。接種疫苗過程，類似一場免疫系統(tǒng)的軍事訓練：在不損傷機體的前提下訓練免疫系統(tǒng)。而所謂的免疫力，實際上就是機體在下次遇到病原時能迅速消滅病原體，讓人（或動物）不發(fā)病的能力。

我們看一個反向遺傳操作系統(tǒng)制作疫苗的例子（圖11）。我們知道，流感會發(fā)生頻繁的突變，每年流行的病毒毒株可能都不相同，換了“馬甲”之后免疫系統(tǒng)就不認識它了。因此我們必須根據(jù)當年所流行的病毒株，來生產(chǎn)新的流感疫苗。

這時就要用到反向遺傳操作系統(tǒng)：① 我們從臨床中檢測到流行強毒株，獲得它的抗原編碼序列，② 然后通過基因工程的方式，將抗原部分的編碼序列重組到疫苗弱毒株的感染性克隆中；③ 然后我們將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)部，就能夠產(chǎn)生帶有強毒株抗原、并且不具有致病性的、弱的新疫苗毒株，就可以用于預防當年所流行的流感。

預防病毒病最有效的方式是研發(fā)疫苗。為了防控新冠疫情，全球科研人員都在努力研發(fā)新型冠狀病毒的疫苗，我國陳薇院士團隊研發(fā)的重組新型冠狀病毒疫苗（腺病毒載體）（“Ad5-nCoV”）已經(jīng)進入 II期臨床試驗。

根據(jù)名字就可以知道，這個疫苗所使用的病毒載體是腺病毒，腺病毒是一種沒有包膜的DNA病毒，我們將腺病毒中能夠?qū)е录膊〉幕蛞约耙恍o關(guān)的基因刪除掉，然后重組引入新型冠狀病毒的抗原蛋白表達基因，就制作完成了以腺病毒載體為基礎(chǔ)的冠狀病毒疫苗。

腺病毒載體的特點是高效率、高滴度（滴度是指病毒的濃度）、低致病性，并且不會整合進入宿主細胞染色體，是一種常用的病毒載體。目前國內(nèi)外的研究者還使用了滅活疫苗、亞單位疫苗、假病毒顆粒、痘病毒載體疫苗及納米顆粒疫苗等策略研發(fā)疫苗（圖12）。其中，納米顆粒疫苗是由病毒抗原及自組裝蛋白組分組成的納米顆粒。

3.病毒也能治病

病毒或病毒載體，還可以應(yīng)用于噬菌體治療、細胞治療、基因治療以及癌癥治療和預防。

由于各種抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，細菌對人類健康的危害大大降低了，但是，抗生素濫用帶來了細菌耐藥性的問題，其中有些細菌具有多重抗生素抗性，我們稱之為超級細菌，超級細菌感染是非常危險的、且在醫(yī)學上是非常棘手的問題，而噬菌體是可以感染細菌的病毒，因此使用噬菌體來治療耐藥菌感染成為細菌感染治療的思路之一。

2015年，加州大學的一對科學家夫婦在埃及旅游途中，丈夫Tom Patterson感染了超級細菌，生命垂危，后來使用噬菌體治療才得以康復（圖13）。

癌癥是一類嚴重威脅人類健康的疾病，而某些病毒可以導致腫瘤的消溶，我們稱之為溶瘤病毒。溶瘤病毒包含腺病毒、痘病毒、甲病毒、新城疫病毒、單純皰疹病毒-1、麻疹病毒等（圖14）。

這些病毒經(jīng)過改造之后，可以用于癌癥治療：一方面不導致疾病，另一方面可以殺死腫瘤細胞。溶瘤病毒治療腫瘤的機制有多種，比如破壞腫瘤血管，切斷腫瘤營養(yǎng)來源，直接殺死腫瘤細胞，或者誘導針對腫瘤的細胞免疫反應(yīng)等等。

人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)就像一支軍隊，可以抵御外來病原體的入侵，同時也可以識別并消滅異常的“叛變”細胞，而有些細胞可以躲過這種監(jiān)視，不被免疫系統(tǒng)所識別和清除，肆意生長，這就是癌細胞。

細胞治療的方法可以借助慢病毒載體，給免疫系統(tǒng)的士兵——T細胞——安裝上能夠識別癌細胞的受體CAR，幫助免疫系統(tǒng)識別并消滅腫瘤（圖15）。慢病毒載體是改造HIV病毒而來的，它的感染效率高，可以將外源基因穩(wěn)定地插入到細胞基因組中，在細胞治療中應(yīng)用廣泛。

隨著基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因治療的前景越來越被看好?；蛑委熓峭ㄟ^改造基因來治療或預防疾病的，它采用的方法主要有替換突變基因，敲除有害基因，或者引入新基因?；蛑委熖貏e適合治療遺傳病，也可以用于治療病毒病或癌癥。

“蝴蝶男孩”的康復是基因治療的一個經(jīng)典例子。2017年，一位患有交界型大皰性表皮松解癥的男孩Hassan因全身皮膚嚴重破損而入院，他的皮膚異常脆弱，一碰就破，面臨生命危險。這一種嚴重的遺傳病，是由皮膚的層黏連蛋白基因異常所導致的，人們形象地將這位患病的孩子稱為“蝴蝶男孩”。

科學家把正常的黏連蛋白基因裝載到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后用病毒感染體外培養(yǎng)的皮膚細胞，這些皮膚細胞被病毒載體引入了正常的基因，從而能夠表達正常的蛋白。在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因皮膚后，把皮膚移植到小孩身體上，逐步取代原來的皮膚，達到治療的目的（圖16）。

脊髓性肌萎縮是一種致死性的遺傳病，患兒的腦干和脊髓中的運動神經(jīng)元逐步被破壞，慢慢失去說話、走路的能力，到最后，甚至無法呼吸和吞咽，最終被奪去性命。研究發(fā)現(xiàn)這種疾病是SMN1基因異常造成的，美國諾華公司開發(fā)的腺病毒相關(guān)病毒載體，可以將正常的SMN1基因裝到病患的基因組上，從而治療這種疾病。

這種病毒載體藥物只需要注射一次，而一次的費用高達200萬美元（圖17）。這里所使用的AAV病毒是復制依賴于腺病毒的缺陷病毒，本身不導致疾病，能夠感染分裂和不分裂的細胞（神經(jīng)細胞通常不分裂），可以定點整合到人19號染色體上，是一種常用的病毒載體。

病毒是導致人類疾病的重要病原體，從古到今，各種病毒都是人類的夢魘，即便是當今社會，面臨新冠疫情，人類健康、經(jīng)濟、社會各方面依然受到極大的沖擊。隨著人與自然的邊界愈加模糊，氣候環(huán)境劇烈變遷，人或動物的國際交流運輸頻繁，新發(fā)病毒病永遠是、而且越來越是一種極其可能發(fā)生、且已經(jīng)或正在發(fā)生的、對人類社會的嚴重威脅。

結(jié)語：

病毒學研究讓我們在新發(fā)病毒病預警、處置和防疫方面有了長足的進步，我們發(fā)現(xiàn)新病毒的速度越來越快，做出有效防疫措施和決策越來越快，藥物和疫苗研發(fā)也越來越快。相較歷史上的歷次瘟疫，人類社會應(yīng)對傳染病的能力已經(jīng)今非昔比。同時，病毒學研究也為生命科學基礎(chǔ)研究、醫(yī)學研究帶來了很多令人矚目的成果。

我們常說，21世紀是生命科學的世紀，很多專家也把基因編輯為代表的生命科學技術(shù)作為第四次工業(yè)革命的主要組成部分，而這一切離不開病毒學工具。因此，病毒學研究不論從生命科學發(fā)展還是人類健康事業(yè)來說，都是非常重要的。

文章來源：微信公眾號：返樸（ID：fanpu2019）