基于腸道上皮細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子探討四妙散對(duì)高尿酸血癥小鼠的祛濕機(jī)制

張志明 高碧珍 齊張旸 吳寬裕 趙鐘文 黃青青 陳世涵

【摘 要】目的：探究四妙散對(duì)高尿酸血癥小鼠回腸組織三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ABCG2）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（GLUT9）表達(dá)的影響。方法：將36只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，四妙散低、中、高劑量組，別嘌醇組，每組6只。除空白對(duì)照組外，其余各組建立高尿酸血癥小鼠模型，四妙散低、中、高劑量組分別給予低劑量（0.175 g·mL-1）、中劑量（0.35 g·mL-1）、高劑量（0.7 g·mL-1）四妙散灌胃，別嘌醇組予別嘌醇（40 mg·kg-1）灌胃。檢測(cè)各組小鼠血尿酸、回腸ABCG2和GLUT9表達(dá)變化，探究四妙散治療高尿酸血癥的可能機(jī)制。結(jié)果：各模型組小鼠血清尿酸明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.05），不同劑量四妙散及別嘌醇治療后小鼠血清尿酸水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），回腸ABCG2表達(dá)升高，GLUT9表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中四妙散中、高劑量組對(duì)ABCG2和GLUT9影響最大。結(jié)論：四妙散通過(guò)調(diào)節(jié)回腸ABCG2及GLUT9的表達(dá)起到降尿酸作用。

【關(guān)鍵詞】 高尿酸血癥;四妙散;三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體G2;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Simiao San（四妙散）on the expressions of ABCG2?and GLUT9 in the ileum of mice with hyperuricemia.Methods：Thirty-six mice were randomly divided into?a blank control group，a model control group，Simiao San low，medium and high dose groups，and an allopurinol group，6 mice in each group.In addition to the blank control group，hyperuricemia mice models were established in the other groups.The Simiaosan low，medium and high dose groups were correspondingly given intragastric administration of low dose（0.175·g·mL-1），medium dose（0.35 g·mL-1），and high dose（0.7 g·mL-1）of Simiao San，so did the allopurinol group with allopurinol（40 mg·kg-1）.The expressions of serum uric acid，ABCG2 and GLUT9 in ileum were detected to explore the possible mechanism of Simiao San in the treatment of hyperuricemia.Results：The level of serum uric acid in mice of each model group was significantly higher than that in the blank control group（P < 0.05）.The serum uric acid level of mice treated with different doses of Simiao San and allopurinol decreased with statistical significance（P < 0.05）.The expression of ABCG2 in ileum increased and the expression of GLUT9 decreased with statistical significance（P < 0.05）.The Simiao San middle and high doses had the greatest impact on ABCG2 and GLUT9.Conclusion：Simiao San can reduce uric acid by regulating the expression of ABCG2?and GLUT9 in ileum.

【Keywords】 hyperuricemia;Simiao San（四妙散）;ABCG2;GLUT9

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄障礙引起的以高水平血尿酸為特征的慢性代謝性疾病。黃嘌呤氧化酶（XOD）是尿酸形成過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶，XOD抑制劑類藥物別嘌醇存在嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)或者肝腎病變的風(fēng)險(xiǎn)，并且治療費(fèi)用昂貴[1-2]。因此，研究不良反應(yīng)小的新型降血尿酸藥物具有重要的臨床意義。四妙散是清熱祛濕的代表方，記載于《成方便讀》，是清·張秉承在《丹溪心法》二妙散基礎(chǔ)上加牛膝、薏苡仁組成[3]。四妙散加減方在現(xiàn)有的研究中均展現(xiàn)了很好的降尿酸作用，改善小鼠腎功能，其作用與抑制XOD活性及抗炎癥反應(yīng)作用有關(guān)[4-6]。本研究意在探明四妙散對(duì)HUA模型小鼠腸道祛濕機(jī)制，為臨床治療HUA提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只4周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體質(zhì)量（20±2）g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)溫度20～22 ℃，濕度50%～70%，自由進(jìn)食及飲水，光照和黑暗12 h更替。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 別嘌醇片（上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)05170205）;四妙散（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院中藥制劑室提供，藥物組成：蒼術(shù)15 g、牛膝10 g、黃柏15 g、薏苡仁30 g）;腺嘌呤（Sigma，生產(chǎn)批號(hào)021M0181V）;兔抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白6（GLUT6）/GLUT9多克隆抗體（Bioss，貨號(hào)bs-13388R）;抗乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ABCG2）單克隆抗體（Abcam，貨號(hào)ab207732）;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）（中杉金橋，貨號(hào)ZB-2301）;小鼠尿酸檢測(cè)試劑盒（上海酶免，貨號(hào)MM44292M2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司，型號(hào)UV-1600PC）;蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C）;超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)Chemi DocTM XRS+]。

2 方 法

2.1 慢性HUA小鼠模型建立及給藥方法 將36只

小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，四妙散低、中、高劑量組，別嘌醇組，每組6只。除空白對(duì)照組外，其余各組造模，給予10%酵母膏飼料喂養(yǎng)，并每日給予腺嘌呤（100 mg·kg-1）處理12 d。各治療組在造模第6天開(kāi)始給藥處理，四妙散各劑量組按照生藥量9.1 g·kg-1和體表面積折算成動(dòng)物的等效劑量，低、中、高劑量組分別為等效劑量的0.5倍（0.175 g·mL-1）、1倍（0.35 g·mL-1）、2倍（0.7 g·mL-1），每只每日按0.26 mL·（10 g）-1灌胃1次，別嘌醇組（40 mg·kg-1）每只每日按照0.2 mL·（10 g）-1灌胃1次，處理7 d后取樣檢測(cè)。

2.2 ELISA檢測(cè) 采用雙抗夾心法檢測(cè)各組小鼠血清中尿酸的含量，小鼠尿酸與微孔板中包被的尿酸捕獲抗體結(jié)合，在與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗脫后加入TMB顯色，TMB在HRP酶催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)樣本設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）并取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的尿酸含量。

2.3 免疫組化 取小鼠回腸組織進(jìn)行石蠟包埋制作石蠟切片;石蠟切片經(jīng)過(guò)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù);然后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫孵育10 min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;接著使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA在37 ℃孵育30 min封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn);加入稀釋好的一抗進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，4 ℃孵育過(guò)夜（一抗稀釋比：GLUT9為1∶400，ABCG2為1∶500）;洗去未結(jié)合的一抗，加入稀釋好的二抗，37 ℃孵育30 min;DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下觀察染色程度;洗去多余染色液，加入蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍(lán);顯微鏡下觀察，細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，目的蛋白呈黃棕色。

2.4 Western Blot檢測(cè) 取各組加入相應(yīng)的裂解液中，4 ℃裂解30 min，離心機(jī)以10 000 r·min-1離心10 min，離心半徑10 cm，小心吸取上清液，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液過(guò)夜;室溫孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性用LSD法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組HUA小鼠血尿酸含量比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組血尿酸含量均 >

200 μmol·L-1，提示造模成功。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組尿酸含量顯著增加（P < 0.01）;與模型對(duì)照組比較，四妙散低、中、高劑量組和別嘌醇組尿酸含量均顯著降低（P < 0.01）;與別嘌醇組比較，不同劑量四妙散組的血尿酸含量無(wú)明顯變化（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

3.2 四妙散對(duì)ABCG2、GLUT9表達(dá)和分布的影響

3.2.1 各組HUA小鼠回腸組織ABCG2分布比較 免疫組化結(jié)果顯示，ABCG2主要分布于腸道內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞中。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組上皮細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)明顯降低;與模型對(duì)照組比較，四妙散低、中、高劑量組和別嘌醇組的ABCG2表達(dá)均明顯升高，其中四妙散中劑量組和別嘌醇組表達(dá)升高最明顯。見(jiàn)圖1。

3.2.2 各組HUA小鼠回腸組織GLUT9分布比較 免疫組化結(jié)果顯示，GLUT9主要分布于腸道內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞中。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組上皮細(xì)胞中GLUT9表達(dá)明顯升高;與模型對(duì)照組比較，四妙散低、中、高劑量組對(duì)GLUT9的表達(dá)均有抑制作用，但不是很明顯，別嘌醇組GLUT9表達(dá)明顯降低。見(jiàn)圖2。

3.3 各組HUA小鼠回腸組織ABCG2和GLUT9蛋白表達(dá)水平比較 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組ABCG2表達(dá)明顯降低，GLUT9表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與模型對(duì)照組比較，四妙散中、高劑量組和別嘌醇組ABCG2蛋白表達(dá)明顯升高（P < 0.05），但四妙散低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;四妙散低、中、高劑量組和別嘌醇組對(duì)GLUT9的表達(dá)均有顯著性抑制作用（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖3。

4 討 論

四妙散出自清·張秉成所著的《成方便讀》，方中黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，入下焦，直清下焦?jié)駸?蒼術(shù)健脾燥濕、祛風(fēng)除濕，有利尿作用;薏苡仁清熱利濕兼健脾;牛膝祛濕熱、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，同時(shí)還可以通血脈而利關(guān)節(jié)，并引藥下行，諸藥相伍使得濕熱得以泄化，痹證得以清除[3]。HUA是人群中常見(jiàn)的代謝性疾病，研究表明，臨床常用的XOD抑制劑別嘌醇存在過(guò)敏反應(yīng)、粒細(xì)胞缺乏癥、腎臟毒性等不良反應(yīng)[7]。本研究結(jié)果表明，給予不同劑量的四妙散和別嘌醇治療之后，模型小鼠血尿酸含量恢復(fù)正常水平，不同劑量四妙散組和別嘌醇組的血尿酸水平無(wú)明顯差異，表明四妙散具有和別嘌醇相同的降尿酸作用。

大部分HUA是由尿酸排泄障礙引起的[8]，大多數(shù)研究主要集中在腎臟對(duì)血尿酸含量的影響，已有研究表明腸道也參與了尿酸排泄，大約有1/3的尿酸通過(guò)腸道排泄[9]。本研究表明，模型組小鼠回腸組織ABCG2的表達(dá)顯著降低

（P < 0.01），而GLUT9的表達(dá)顯著升高（P < 0.01），提示ABCG2及GLUT9的表達(dá)參與了HUA的發(fā)展過(guò)程。與ELISA檢測(cè)結(jié)果相一致，表明四妙散可以通過(guò)上調(diào)ABCG2表達(dá)促進(jìn)尿酸排泄，另外通過(guò)下調(diào)GLUT9表達(dá)抑制尿酸重吸收，從而產(chǎn)生降尿酸作用。有研究表明，甲狀腺功能亢進(jìn)容易導(dǎo)致HUA，其機(jī)制是甲狀腺旁腺激素會(huì)抑制腸、腎ABCG2的表達(dá)導(dǎo)致尿酸排泄減少[10-11]。DINOUR等[12]研究表明，GLUT9缺陷者尿酸排泄率為健康受試者的1.5倍，表明抑制GLUT9的表達(dá)能夠抑制尿酸的重吸收，促進(jìn)尿酸排泄。本研究結(jié)果表明，四妙散低、中、高劑量組均能顯著促進(jìn)回腸組織中ABCG2的表達(dá)和降低GLUT9的表達(dá)影響血尿酸含量，其中四妙散中、高劑量組的影響最明顯，四妙散低劑量略低于中、高劑量組，因此，ABCG2和GLUT9可以作為降尿酸藥物的靶點(diǎn)，四妙散與別嘌醇具有相同的降高尿酸作用，且四妙散使用藥食同源和保健食品目錄中藥材，長(zhǎng)期服用無(wú)明顯不良反應(yīng)。

綜上所述，四妙散可以明顯降低HUA模型小鼠的血尿酸含量，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子，即上調(diào)回腸組織ABCG2的表達(dá)和抑制GLUT9的表達(dá)，增加尿酸清除達(dá)到對(duì)高尿酸鼠祛濕的作用，也為中藥作用的多靶點(diǎn)與多途徑客觀優(yōu)勢(shì)提供了理論依據(jù)。

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收稿日期：2019-06-16;修回日期：2019-07-29