超高效液相色譜法測定肉類食品中甲氧氯普胺的含量

尹青春 鄧浩 譚高好 徐彬 朱琰婷 王運選 劉陽麗

摘 要：建立超高效液相色譜法測定肉類食品中甲氧氯普胺含量的檢測方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)HLB小柱凈化后，采用C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），乙腈-0.1%甲酸水溶液（20∶80，V/V）為流動相，流速0.3 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫35 ℃，進樣量3.0 μL。結果表明：甲氧氯普胺在1～100 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，R2=0.999 5，檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg，相對標準偏差為0.79%～5.27%（n=12），平均回收率為87.0%～106.0%。所建立的方法適用于檢測肉類食品中甲氧氯普胺的含量。

關鍵詞：超高效液相色譜法;甲氧氯普胺;肉類食品

Abstract： An analytical method for the quantitative determination of metoclopramide in meat by ultra-high performance liquid chromatography （UPLC） was established in this paper. Samples were extracted with acetonitrile and then the extract was purified using an HLB cartridge. The chromatographic separation was accomplished on a C18 column （2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm）?using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid in water （20：80， V/V） at a flow rate of?0.3 mL/min. The detection wavelength was 275 nm and the column temperature was 35 ℃. The injection volume was?3.0 μL. The results showed that the linear range of metoclopramide was from 1 to 100 mg/L （R2 = 0.999 5）. The limit of detection was 0.25 mg/kg， and the limit of quantitation was 0.5 mg/kg. The precision， expressed as relative standard derivation （RSD） was 0.79%–5.27% （n = 12）. The average recovery was 87.0%–106.0%. The developed method proved to be applicable to the determination of metoclopramide in meat.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography; metoclopramide; meat

甲氧氯普胺又名滅吐靈、胃復安，為多巴胺D2受體拮抗劑，獸藥原料藥，主要抑制延髓催吐化學感受區(qū)，有較強的止吐作用，促進胃腸蠕動和胃功能恢復正常[1-3]，臨床上主要用于鎮(zhèn)吐，副作用是會引起患者昏睡、煩燥不安、疲怠無力等。由于甲氧氯普胺價格低廉，經(jīng)常違規(guī)使用，引發(fā)多種不良反應[4-7]?！吨腥A人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第560號》指出，人用胃腸道藥品用于動物源性食品缺乏殘留檢測實驗數(shù)據(jù)，會增加動物源性食品中藥物殘留危害，因此明確規(guī)定動物源性食品中甲氧氯普胺為禁用獸藥。SN/T 2227—2008《進出口動物源性食品中甲氧氯普胺殘留量檢測方法》適用于豬肉、豬肝、魚、蝦、雞蛋中甲氧氯普胺的檢測，說明甲氧氯普胺在動物源性食品中均可能有殘留。日本規(guī)定了鰻魚、雞肉、魚片、去殼軟體動物、甲殼類（螃蟹）、豬肉、凍蝦仁、牛肉、蜂蜜等動物源性食品中甲氧氯普胺的殘留限量，其中水生動物、雞肉、鴨肉、鵝肉、蜂蜜中甲氧氯普胺的殘留限量為0.005 μg/mL，牛肝臟中甲氧氯普胺的殘留限量為0.03 μg/mL[8]。

近年來，國內(nèi)外文獻報道多集中于測定甲氧氯普胺血藥濃度以及測定鹽酸甲氧氯普胺注射液中甲氧氯普胺的含量等，檢測方法有高效液相色譜（high pressure liquid chromatography，HPLC）[9-11]、液相色譜-質譜[12-16]、毛細管電泳[17-18]、化學發(fā)光法[19-21]、紫外-可見分光光度法[22]、氣相色譜法[23]等。超高壓液相色譜法（ultra-high pressure liquid chromatography，UPLC）借助HPLC的理論及原理，增加了分析通量、靈敏度及色譜峰容量，廣泛應用于生命科學、醫(yī)藥化學及食品衛(wèi)生等方面。多位學者相繼報道了利用UPLC進行藥物分析及食品檢測的研究工作[24-26]，但是UPLC測定肉類食品中甲氧氯普胺的研究少有報道。本研究從肉類食品中提取甲氧氯普胺所需提取溶劑、酸堿試劑對提取的影響、凈化小柱的選擇、流動相的選擇方面進行優(yōu)化，建立UPLC測定肉類食品中甲氧氯普胺類獸藥的檢測方法，可為肉類食品分析檢測工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉、豬肉、牛肉當天購于?？谑薪鹇共耸袌?，雞肉當天購于海口市東門菜市場。抽檢樣品（用于檢測樣品中甲氧氯普胺殘留含量）信息如表1所示。

甲氧氯普胺標準品（純度99.8%） 中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國Merck公司;Oasis HLB柱（3 mL，60 mg）、酸性氧化鋁柱（3 mL，500 mg） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器） 美國Waters公司;Turbo Vap LV氮吹儀 力德生物科技（上海）有限公司;XS205十萬分之一分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

準確稱取10.0 mg甲氧氯普胺標準品于10 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL溶解，用甲醇定容，配制成1 000 mg/L甲氧氯普胺標準儲備液;將1 000 mg/L甲氧氯普胺標準儲備液用甲醇稀釋為100 mg/L甲氧氯普胺標準液，取適量100 mg/L甲氧氯普胺標準液配制成1、5、10、20、50、100 mg/L系列甲氧氯普胺標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

精確稱取2 g樣品至50 mL離心管中，加入2.0 g無水Na2SO4，再加入5 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，10 000 r/min離心3 min，殘渣再加入5 mL乙腈重復提取1 次，合并上清液，待凈化。取Oasis HLB柱，用3 mL乙腈淋洗活化小柱，取樣品上清液過柱，再用5 mL乙腈淋洗小柱1 次，置于50 mL氮吹管中，于45 ℃條件下氮吹至干，殘留物加入1.0 mL甲醇-水溶液（80∶20，V/V）復溶，復溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，作為待測液。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（20∶80，V/V）;流速0.3 mL/min;檢測波長275 nm;柱溫35℃;進樣量3.0 μL。以保留時間定性，峰面積定量。在上述色譜條件下，甲氧氯普胺保留時間為1.711 min。

1.3.4 結果計算

式中：C為試樣中甲氧氯普胺殘留量/（mg/kg）;ρ為儀器檢測得出的試樣中甲氧氯普胺殘留質量濃度/（mg/L）;V為試樣最終定容體積/mL;m為試樣質量/g。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

選擇合適的流動相能使目標物較好地分離。按照1.3.2節(jié)的色譜條件，比較甲醇-水（30∶70，V/V）、甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70，V/V）、乙腈-0.1%甲酸水溶液（20∶80，V/V）3 種不同的流動相對目標物色譜峰的影響，標準品進樣質量濃度為10.0 mg/L。

由圖1～2可知，在流動相的水相中加入一定量的酸能使甲氧氯普胺的峰形更加尖銳，檢測靈敏度也得到提高，本研究選擇在流動相的水相中加入0.1%甲酸控制溶液pH值，得到較好的分離效果。甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相會使色譜峰分叉，由圖3可知，將有機相甲醇換成乙腈后，峰形尖銳不分叉，且目標物保留時間依然保持在1.7 min左右。因此，本研究選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液（20∶80，V/V）作為流動相。

普通HPLC法所用流動相配制復雜，進樣量大，目標物保留時間較長。例如：劉翔[27]采用普通HPLC法測定鹽酸甲氧氯普胺注射液中甲氧氯普胺的含量，流動相為甲醇-乙腈-醋酸鹽緩沖液（10∶15∶75，V/V，含0.1%三乙胺，pH 4），進樣體積20 μL，目標物保留時間為7 min左右;石杰等[11]也采用普通HPLC法測定鹽酸甲氧氯普胺注射液中甲氧氯普胺的含量，所用流動相為乙腈-0.025 mol/L乙酸銨（20∶80，V/V，含0.2%三乙胺，冰醋酸調pH值至5.7），進樣體積20 μL，目標物保留時間為7 min左右;范先鵬[28]、王靜文[29]等采用普通HPLC法分別測定甲氧氯普胺鼻腔噴霧劑及魚腥草注射液中甲氧氯普胺含量，目標物保留時間均為9 min左右。相比普通HPLC，本研究流動相配制更簡單、進樣量更少、目標物保留時間更短，大大提高了檢測效率，更適合批量檢測肉類食品中甲氧氯普胺的含量。

2.2 提取溶劑的選擇

以陰性豬肉為基質，在基質中添加一定量的甲氧氯普胺標準品，比較乙腈和甲醇作為提取溶劑的提取效果，回收率測定參考萬譯文[30]、張秀清[31]等的方法。

用液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測，前處理步驟均采用乙腈作為提取溶劑，回收率為63.3%～119.5%。普通HPLC法檢測注射液中的甲氧氯普胺含量時多采用流動相或甲醇進行提取，可能是由于甲氧氯普胺藥物注射液成分較簡單，而動物源性食品的基質成分復雜，乙腈能較好地從肉類基質中提取出甲氧氯普胺。

2.3 酸堿試劑的影響

以陰性豬肉為基質，在基質中添加一定量的甲氧氯普胺標準品，以乙腈作為提取溶劑，在甲氧氯普胺提取過程中加入0.1 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉、0.1 mL 0.1 mol/L鹽酸，與空白對照組進行比較，確定酸堿試劑對甲氧氯普胺提取及測定結果的影響。

由表3可知，在提取過程中加入酸堿試劑對甲氧氯普胺提取效果無明顯影響，說明甲氧氯普胺在一定pH值范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，方法專屬性較強。范先鵬等[28]采用HPLC法測定甲氧氯普胺鼻腔噴霧劑中甲氧氯普胺的含量和有關物質時，進行了一項強制破壞實驗，對甲氧氯普胺供試品分別進行堿（1 mol/L氫氧化鈉溶液）、酸（1 mol/L鹽酸溶液）、氧化（質量分數(shù)3%的過氧化氫溶液）、光照（（4 500±500） lx光照5 d）等破壞處理后進樣分析，結果表明，幾種處理對測定均無干擾，但在破壞溶液的色譜圖中均有不同程度的降解產(chǎn)物產(chǎn)生，各降解產(chǎn)物均與主峰有良好的分離度，同樣表明甲氧氯普胺在一定pH值范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.4 凈化小柱的選擇

已有文獻報道中，采用液相色譜-質譜法檢測甲氧氯普胺含量時多采用酸性氧化鋁柱。本研究以陰性豬肉為基質，在基質中添加一定量的甲氧氯普胺標準品，以乙腈作為提取溶劑，比較Oasis HLB柱（3 mL，60 mg）、酸性氧化鋁柱（3 mL，500 mg）2 種不同的固相萃取柱對甲氧氯普胺的凈化效果。

由表4可知，HLB柱和酸性氧化鋁柱凈化效果均較好。HLB柱具有適合小分子和治療性多肽分析、靈敏度更高、基質效應更低的優(yōu)點，且適用于酸性、堿性和中性分析物。由于本研究樣品為肉類食品，基質成分復雜，所需凈化小柱的pH值應有較大的范圍，以適應不同基質樣品的提取凈化，綜合考慮，本研究選擇Waters Oasis HLB柱（3 mL，60 mg）作為凈化柱。

2.5 線性范圍和靈敏度

分別吸取1、5、10、20、50、100 mg/L系列甲氧氯普胺標準工作液，根據(jù)其所得峰面積（y）與對應標準溶液的質量濃度（x）繪制標準曲線，得到甲氧氯普胺質量濃度1～100 mg/L范圍內(nèi)呈線性關系，其標準曲線方程為y=2.26×104x+1.63×104（R2=0.999 5），線性關系良好，可滿足定量分析的要求。

在方法規(guī)定的取樣質量條件下，在陰性豬肉樣品中添加甲氧氯普胺標準儲備液（添加水平為0.25 mg/kg），經(jīng)測定信噪比（RS/N）均大于3，表明目標物的檢測限為0.25 mg/kg。在陰性豬肉樣品中添加甲氧氯普胺標準儲備液（添加水平為0.5 mg/kg），經(jīng)測定RS/N均大于10，表明其定量限為0.5 mg/kg。陰性豬肉樣品及甲氧氯普胺添加量0.5 mg/kg的陰性豬肉樣品色譜圖如圖4所示。

在不同的基質（魚肉、豬肉、牛肉、雞肉）中分別添加4、10、25 mg/kg 3 個水平的甲氧氯普胺標準品，每個添加水平設12 個平行，進行加標回收率實驗。由表5可知，平均回收率為87.0%～106.0%，相對標準偏差為0.79%～5.27%，說明方法精密度較好，且具有較好的重復性，適用于肉類食品中甲氧氯普胺的檢測。

2.7 樣品測定

通過本研究建立的UPLC法對海南省各市縣菜市場抽檢的魚肉、豬肉、牛肉和雞肉4 類樣品中甲氧氯普胺的殘留量進行測定，每個樣品平行測定2 次。

測定18 個市縣抽檢的各肉類樣品共72 個，均未檢出甲氧氯普胺類獸藥。雖然目前在海南省各市縣抽檢的部分魚肉、豬肉、牛肉和雞肉中未檢出甲氧氯普胺類獸藥，但仍需加強獸藥殘留檢測的必要性，把控動物源性食品的安全風險。

3 結 論

建立UPLC法測定肉類食品中甲氧氯普胺含量的檢測方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)HLB小柱凈化后，采用C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），乙腈-0.1%甲酸水溶液（20∶80，V/V）為流動相，流速0.3 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫35 ℃，進樣量3.0 μL。結果表明：甲氧氯普胺在1～100 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，R2=0.999 5，檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg，相對標準偏差為0.79%～5.27%（n=12），平均回收率達87.0%～106.0%。所建立的檢測方法符合國內(nèi)外有關標準和法規(guī)的要求，相比普通HPLC法，本方法的流動相配制更簡單、進樣量更少、目標物保留時間更短，且干擾性小、線性范圍廣，大大提高了檢測效率，更適合批量檢測肉類食品中甲氧氯普胺的含量。

參考文獻：

[1] 趙振， 李玲. 針刺聯(lián)合鹽酸甲氧氯普胺注射液治療急性胃腸炎所致嘔吐的臨床療效觀察[J]. 甘肅科技， 2018， 34（16）： 116; 119-120. DOI：10.3969/j.issn.1000-0952.2018.16.041.

[2] 黃榕彬， 劉文輝， 谷鐵波， 等. 含鉑化療相關性呃逆的不良反應臨床分析[J]. 實用藥物與臨床， 2019（11）： 85-88. DOI：10.14053/j.cnki.ppcr.201911019.

[3] 陳飛， 程祺， 楊雅雯. 托烷司瓊針、甲氧氯普胺針獨用及合用對腫瘤化療惡心、嘔吐的預防效果評價[J]. 中國醫(yī)藥科學， 2015， 5（24）： 48-50.

[4] 張瑞平. 甲氧氯普胺中毒1 例[J]. 醫(yī)學美學美容旬刊， 2015（5）： 766.

[5] 陸雯. 早孕婦女妊娠劇吐28 例的臨床治療分析[J]. 世界最新醫(yī)學信息文摘， 2019， 19（89）： 103; 107. DOI：10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.89.064.

[6] GOOL A R V， DOORDUIJN J K， SEYNAEVE C. Severe akathisia as a side effect of metoclopramide[J]. Pharmacy World and Science， 2010， 32（6）： 704-706. DOI：10.1007/s11096-010-9444-3.

[7] 國家藥品不良反應監(jiān)測中心. 藥品不良反應信息通報： 警惕甲氧氯普胺引起的錐體外系反應[J]. 中國藥物警戒， 2016， 2（13）： 123. DOI：10.19803/j.1672-8629.2016.02.018.

[8] 農(nóng)藥甲氧氯普胺的基本信息[EB/OL]. （2019-05-11） [2019-09-24]. http：//db.foodmate.net/pesticide/show_3315.html.

[9] SEVGI T U. High performance liquid chromatography for the determination of metoclopramide in pharmaceutical preparations using pre-column derivatization with fluorescamine[J]. Chinese Journal of Chemistry， 2012， 30（3）： 634-638. DOI：10.1002/cjoc.201280001.

[10] SANNA V. A new sensitive reversed-phase high-performance liquid chromatography method for the quantitative determination of metoclopramide in canine plasma[J]. Analytical Letters， 2008， 41（5）： 767-778. DOI：10.1080/00032710801934601.

[11] 石杰， 王興輝， 聞京偉， 等. RP-HPLC法測定鹽酸甲氧氯普胺注射液含量及有關物質[J]. 藥物分析雜志， 2010， 30（1）： 117-119. DOI：10.16155/j.0254-1793.2010.01.045.

[12] BAYRAK Z， KURBANOGLU S， SAVASER A， et al. LC-MS method for the sensitive determination of metoclopramide： application to rabbit plasma， gel formulations and pharmaceuticals[J]. Chromatographia， 2014， 77（1/2）： 99-107. DOI：10.1007/s10337-013-2568-6.

[13] INAMADUGU J K， DAMARAMADUGU R， MULLANGI R， et al. Sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of metoclopramide in human plasma： application to a bioequivalence study[J]. Biomedical Chromatography， 2010， 24（9）： 1006-1014. DOI：10.1002/bmc.1401.

[14] HAMAMOTO K， MIZUNO Y， KATO M， et al. Simple and sensitive method for measurement of metoclopramide in cattle plasma by

LC-MS/MS using a multimode chromatography[J]. Journal of Veterinary Medical Science， 2013， 75（4）： 509-513. DOI：10.1292/jvms.12-0220.

[15] 中華人民共和國海南出入境檢驗檢疫局. 進出口動物源性食品中甲氧氯普胺殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法： SN/T 2227—2008[S]. 北京： 中國標準出版社， 2009.

[16] 曹慧， 施元旭， 王璐璐. UPLC-MS/MS技術測定豬肉中甲氧氯普胺不確定度評價[J]. 食品工業(yè)科技， 2017， 38（9）： 267-270. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.042.

[17] SULTAN M A， MAHER H M， ALZOMAN N Z， et al. Capillary electrophoretic determination of antimigraine formulations containing caffeine， ergotamine， paracetamol and domperidone or metoclopramide[J]. Journal of Chromatographic Science， 2013， 51（6）： 502-510. DOI：10.1093/chromsci/bms175.

[18] 周考文， 顧雪梅， 崔曉超， 等. 毛細管電泳電致化學發(fā)光法測定家犬體內(nèi)甲氧氯普胺的血藥濃度[J]. 化學學報， 2011， 69（2）： 221-225.

[19] 熊海濤， 唐志華， 聶峰， 等. 流動注射化學發(fā)光分析法測定片劑甲氧氯普胺[J]. 分析測試學報， 2013， 32（2）： 244-248. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.018.

[20] 劉偉， 孫麗， 章竹君. 測定甲氧氯普胺的化學發(fā)光新體系[J]. 陜西師范大學學報（自然科學版）， 2006， 34（3）： 59-61. DOI：10.3321/j.issn：1672-4291.2006.03.015.

[21] HUN Xu， ZHANG Zhujun. Electrogenerated chemiluminescence sensor for metoclopramide determination based on Ru（bpy）32+ -doped silica nanoparticles dispersed in Nafion on glassy carbon electrode[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2008， 47（4/5）： 670-676. DOI：10.1016/j.talanta.2004.11.020.

[22] 苗愛東， 王本富， 彭燕. 紫外分光光度法測定甲氧氯普胺片含量的不確定度評價[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志， 2010， 22（增刊1）： 33-34. DOI：10.3969/j.issn.2095-140X.2010.z1.031.

[23] 趙磊， 于丹， 趙賓， 等. 甲氧氯普胺片的氣相色譜分析方法[J].

中國合理用藥探索， 2017， 14（9）： 75-77. DOI：10.3969/j.issn.2096-3327.2017.09.008.

[24] 劉洋. 超高效液相色譜及其于藥物分析領域的應用[J]. 輕工科技， 2015（3）： 108-109.

[25] 楊喬森. 超高效液相色譜的特點分析及在藥物領域的應用[J]. 中國石油和化工標準與質量， 2012， 33（9）： 230. DOI：10.3969/j.issn.1673-4076.2012.10.201.

[26] 鐘慈平. 固相萃取-超高效液相色譜檢測食品中直接紅染料方法的研究[D]. 重慶： 西南大學， 2014.

[27] 劉翔. HPLC法測定鹽酸甲氧氯普胺注射液中甲氧氯普胺的含量[J]. 安徽醫(yī)藥， 2010， 14（7）： 779-781. DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2010.07.017.

[28] 范先鵬， 孫建緒， 肖軍海， 等. HPLC法測定甲氧氯普胺鼻腔噴霧劑的含量和有關物質[J]. 軍事醫(yī)學， 2015（2）： 133-135. DOI：10.7644/j.issn.1674-9960.2015.02.013.

[29] 王靜文， 范強， 龔旭昊， 等. 魚腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺的HPLC-PDA檢測方法的建立[J]. 中國獸藥雜志， 2016， 50（3）： 45-48.

[30] 萬譯文， 黃向榮， 索紋紋， 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的含量[J]. 湖南飼料， 2014（4）： 16-18. DOI：10.3969/j.issn.1673-7539.2014.04.010.

[31] 張秀清， 陳俊秀， 李文廷， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定酸奶中的喹乙醇及其代謝物[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2019， 29（6）： 651-653.