羊骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體的制備及其特性

劉靜靜 王振華 李素紅 張靜 吳萌 杜順豐 張巖 李春生

摘 要：制備抗羊骨骼肌肌鈣蛋白T（skeletal muscle troponin T，sTnT）的單克隆抗體，評(píng)價(jià)單抗的特性。通過煮沸提取、切膠純化制備sTnT，融合后獲得分泌抗羊sTnT的雜交瘤細(xì)胞株，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)單抗效價(jià)、亞型、特異性等。結(jié)果表明：篩選后獲得3 株單克隆抗體（2E11、3D3、4C2），其中4C2特異性好，效價(jià)達(dá)到15.12×105以上，為IgG1亞型，親和常數(shù)（Ka）為1.1×109 L/mol;免疫印跡結(jié)果顯示，該單抗能與牛、羊的骨骼肌提取物反應(yīng)，與雞、鴨的骨骼肌提取物無明顯反應(yīng)，表明4C2可以用于區(qū)分反芻動(dòng)物和禽類的骨骼肌組織。

關(guān)鍵詞：羊骨骼肌肌鈣蛋白T;單克隆抗體;肉類來源;免疫鑒別;特異性

Abstract： Monoclonal antibody against sheep skeletal muscle troponin T （sTnT） was prepared and its properties were evaluated. For this aim， sTnT was prepared by extraction in boiling NaCl solution and purified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis. Hybridoma cell lines with stable secretion of sTnT were obtained after fusion. The titer， subtype and specificity of monoclonal antibodies were analyzed by enzyme linked immunosorbent assay. Three stable monoclonal antibodies （2E11， 3D3 and 4C2） were obtained after cloning. Among these， 4C2 had the best specificity with a titer of 1：5.12 × 105. The subtype of 4C2 was IgG1 and its affinity constant was 1.1 × 109 L/mol. Western blot results showed that the monoclonal antibody reacted with bovine and sheep skeletal muscle extracts but not chicken and duck skeletal muscle extracts. Accordingly， 4C2 could allow discrimination of ruminant from poultry skeletal muscle.

Keywords： sheep skeletal muscle troponin T; monoclonal antibody; meat sources; immunological identification; specificity

肉類食品鮮香味美、營(yíng)養(yǎng)豐富，一直以來在百姓餐桌上占據(jù)重要位置[1-4]。但在國(guó)內(nèi)及國(guó)際貿(mào)易中，在牛、羊肉中攙雜價(jià)格便宜的鴨肉、以次充好的欺騙行為屢見不鮮[5-6]。目前，肉類來源的鑒別方法主要有：1）顯微鏡觀察法，通過鑒定肉制品的味道、顏色和肉類紋理等進(jìn)行判別，但是這種方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，對(duì)工作人員的技術(shù)要求高[7-9];2）基因方法，如核酸探針雜交、DNA指紋分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和PCR特異擴(kuò)增[9-12]，這類方法鑒定結(jié)果比較準(zhǔn)確，但是成本較高，而且由于DNA沒有組織特異性，對(duì)同一物種的肌肉、脂肪、血液等無法區(qū)分[13-15];3）免疫學(xué)檢測(cè)方法，如免疫印跡、瓊脂擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[16-18]，ELISA方法操作簡(jiǎn)單快速，應(yīng)用最為廣泛[19-20]。

在加工過程中，肉類通常要經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理，DNA和蛋白質(zhì)損失較大，隨著熱穩(wěn)定蛋白及其抗體的研究，這一問題得到解決[21-22]。肌鈣蛋白（troponin，Tn）為橫紋肌結(jié)構(gòu)蛋白，是肌肉收縮系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)蛋白，由TnC、TnT、TnI 3 個(gè)亞基組成[23-24]。Chen等[25-26]研究證實(shí)，豬TnI為熱穩(wěn)定標(biāo)志蛋白，并建立ELISA測(cè)定動(dòng)物飼料中動(dòng)物肌肉的方法。Rencova等[27]用不同動(dòng)物肌肉組織的熱提取物作為抗原，制備兔多克隆抗體，并建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，成功鑒別熱加工的雞、馬、袋鼠和老鼠的肌肉組織。Kim等[28]用腸道平滑肌的加熱提取物制備單抗，可以用于動(dòng)物飼料中肉骨粉的免疫學(xué)檢測(cè)。本研究將羊骨骼肌經(jīng)煮沸提取、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）得到TnT條帶，制備特異性單抗，并對(duì)抗體特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為羊肉免疫學(xué)鑒定方法的建立和產(chǎn)品檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HAT培養(yǎng)基（HAT media supplement（50×），

Hybri-MaxTM）、HT培養(yǎng)基（HT media supplement（50×），Hybri-MaxTM）、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、免疫球蛋白亞型試劑盒 美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）?北京中杉金橋生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BALB/c小鼠 河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

90-2磁力攪拌器 上海浦江分析儀器廠;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;CKX41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司;1510酶標(biāo)儀、ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó)Thermo公司;VORTEX 1漩渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠;D37520臺(tái)式冷凍離心機(jī)、移液器 德國(guó)Eppendorf公司;FluorChem? HD2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Alpha公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的提取

取羊骨骼肌去除脂肪和結(jié)締組織，研磨混勻，稱取20 g，加入0.15 mol/L NaCl溶液（1∶2，m/V）;渦旋混勻后，超聲提取5 min（100 W），煮沸20 min后，5 000×g離心20 min;去除沉淀，取上清過濾后作為檢測(cè)原;采用相同方法提取，經(jīng)離心后，取上清于121 ℃高壓處理30 min，5 000×g離心30 min，上清用Whatman 1號(hào)濾紙過濾，濾液加入90%乙醇（1∶3.74，V/V），靜置2 h;混合液7 000×g離心20 min，取沉淀烘干，為免疫原提取物，經(jīng)SDS-PAGE后切膠用于免疫[20]。

1.3.2 SDS-PAGE鑒定

選擇12%分離膠、5%濃縮膠，對(duì)檢測(cè)原、免疫原提取物進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.3.3 動(dòng)物免疫

BALB/c小鼠頸背部注射免疫原，每隔2 周加強(qiáng)免疫1 次，3 免后7～10 d斷尾取血，間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選取免疫效果最佳的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.3.4 單克隆抗體的制備

采用聚乙二醇法進(jìn)行融合，融合7 d后，出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)換用HT培養(yǎng)基;上清液用間接ELISA方法檢測(cè)，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞;檢測(cè)結(jié)果為陽性的孔，挑選吸光度較高的單個(gè)克隆，通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至得到穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株;小鼠體內(nèi)誘生腹水，采用辛酸-硫酸銨沉淀的方法純化[30]。

1.3.5 單克隆抗體特性鑒定

1.3.5.1 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

參考劉青濤[17]的方法，并稍作修改。采用間接ELISA法進(jìn)行抗血清效價(jià)測(cè)定，具體步驟如下：檢測(cè)原質(zhì)量濃度為5 μg/mL，96孔酶標(biāo)板每孔100 μL，4 ℃包被過夜;以含體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為洗液，洗滌3 次，每次用量300 mL，拍干（下同）;每孔加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的洗液封閉，37 ℃孵育2 h;洗滌、拍干;將待測(cè)血清稀釋1 000 倍，每孔加入100 μL，并且設(shè)置空白對(duì)照孔（PBS）和陰性對(duì)照孔（陰性血清），37 ℃孵育45 min;洗滌、拍干;每孔加入100 μL稀釋10 000 倍的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min;洗滌、拍干;每孔加入底物顯色液100 μL，37 ℃避光反應(yīng)15 min;每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng);450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），陰性對(duì)照孔吸光度為A1，陽性對(duì)照孔為A2，以A2/A1≥2.1為陽性結(jié)果。

1.3.5.2 單克隆抗體亞型測(cè)定

按免疫球蛋白亞型試劑盒說明書步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.3 單克隆抗體特異性測(cè)定

用間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體與牛、羊、雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價(jià)，提取方法同1.3.1節(jié)。

1.3.5.4 免疫印跡

參考康潔[30]的方法。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)封閉、洗膜，加入稀釋的辛酸-硫酸銨純化抗體，洗膜后加入稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，洗膜后加入顯色液，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3.5.5 單克隆抗體親和力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[29]的方法，采用間接ELISA法測(cè)定親和常數(shù)（Ka）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Gradpad作圖軟件、Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的提取及測(cè)定

對(duì)羊骨骼肌進(jìn)行提取后，得到固體物質(zhì)115 mg，得率為0.57%。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定，免疫原提取物蛋白含量為48.7%;用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)得檢測(cè)原質(zhì)量濃度為10.2 mg/mL。

2.2 SDS-PAGE結(jié)果

泳道1. 檢測(cè)原;泳道2. 免疫原提取物。

由圖1可知，帶形清晰、顏色較深的條帶有3 條，對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量約為37、24、17 kDa，與文獻(xiàn)[30]報(bào)道的骨骼肌的TnT、TnI、TnC亞基分子質(zhì)量相符。與檢測(cè)原相比，免疫原提取物雜帶較少，顏色較深，證明經(jīng)過進(jìn)一步處理的抗原純度更高。取37 kDa條帶研磨后用于免疫。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

融合后出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)，取上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)陽性克隆，陽性孔繼續(xù)進(jìn)行亞克隆，直至全陽性。經(jīng)過3～4 次亞克隆，篩選出羊骨骼肌肌鈣蛋白T（skeletal muscle troponin T，sTnT）單克隆抗體細(xì)胞株3 株，分泌的單克隆抗體分別命名為2E11、3D3、4C2。

2.4 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

小鼠腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化后即為單抗，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度，間接ELISA測(cè)定效價(jià)。由表1可知，3 株單克隆抗體細(xì)胞株分泌的抗體效價(jià)均在105以上。

2.5 單克隆抗體亞型測(cè)定結(jié)果

采用間接ELISA方法測(cè)定3 種單克隆抗體的亞型。由圖2可知，不同雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體與不同亞型的抗體顯色有明顯差異，其中2E11與抗體IgG1反應(yīng)的A450 nm最高，與抗體IgM反應(yīng)的A450 nm較低，而與抗體IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA反應(yīng)的A450 nm均低于0.2;4C2與抗體IgG1反應(yīng)的A450 nm最高，與抗體IgA、IgM反應(yīng)的A450 nm較低，而與抗體IgG2a、IgG2b、IgG3反應(yīng)的A450 nm均低于0.2;因此2E11、4C2分泌的抗體類型以IgG1為主。3D3與抗體IgM反應(yīng)的A450 nm最高，與抗體IgG1反應(yīng)的A450 nm較低，與抗體IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA反應(yīng)的A450 nm均低于0.2，因此3D3分泌的抗體類型以IgM為主。

2.6 單克隆抗體特異性測(cè)定

由圖3可知：2E11與牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物反應(yīng)效價(jià)分別為1∶1.0×106、1∶2.0×106、1∶1.0×106、1∶5.1×105，與魚骨骼肌提取物也有明顯反應(yīng);3D3與牛、羊骨骼肌提取物的反應(yīng)效價(jià)均為1∶2.5×105，與雞、鴨、魚骨骼肌提取物的反應(yīng)效價(jià)低于1∶5.1×103;4C2與羊骨骼肌提取物反應(yīng)效價(jià)為1∶2.0×106，與牛骨骼肌提取物反應(yīng)效價(jià)為1∶1.0×106，與雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價(jià)低于1∶2.5×105。2E11與雞、鴨、魚的交叉反應(yīng)較高，3D3的特異性較好，但效價(jià)相對(duì)較低，綜合評(píng)價(jià)得出，4C2效價(jià)較高、特異性較好，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.7 單克隆抗體免疫印跡

泳道1. 羊骨骼肌提取物;泳道2. 牛骨骼肌提取物;泳道3. 鴨骨骼肌提取物;泳道4. 雞骨骼肌提取物。

由圖4可知，4C2分別與轉(zhuǎn)印有牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物的聚偏二氟乙烯膜反應(yīng)，顯色后僅在牛、羊骨骼肌提取物的37 kDa位置出現(xiàn)單一條帶，而雞、鴨骨骼肌提取物無明顯條帶，初步證實(shí)4C2能結(jié)合牛、羊骨骼肌提取物，主要結(jié)合骨骼肌TnT亞基，不與雞、鴨骨骼肌提取物結(jié)合。

2.8 單克隆抗體Ka

采用間接ELISA法測(cè)定4C2的Ka，以抗體質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以A450 nm為縱坐標(biāo)，繪制S型曲線，經(jīng)計(jì)算，Ka為1.1×109 L/mol，表明4C2的親和力較高。

3 結(jié) 論

將羊骨骼肌經(jīng)過粗提，免疫小鼠后進(jìn)行融合，篩選高效價(jià)、高特異性的單克隆抗體，最后獲得3 株穩(wěn)定分泌抗羊骨骼肌肌鈣蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀方法進(jìn)行純化，得到單克隆抗體。經(jīng)過鑒定，4C2特異性較好，與羊骨骼肌提取物的反應(yīng)效價(jià)為1∶2.0×106，與牛骨骼肌提取物的反應(yīng)效價(jià)為1∶1.0×106，與雞、鴨骨骼肌提取物的反應(yīng)效價(jià)低于1∶2.5×105，特異性較好。4C2的類型以IgG1為主，Ka為1.1×109 L/mol。免疫印跡結(jié)果顯示，4C2能夠用于區(qū)分牛、羊和雞、鴨的骨骼肌提取物，在37 kDa條帶顯色，證明4C2是骨骼肌TnT的抗體，且可以用于區(qū)分反芻動(dòng)物和禽類的骨骼肌組織。本研究為食品中羊肉源性成分免疫學(xué)鑒別方法的建立提供了參考。

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