肉莢云實(shí)果殼化學(xué)成分的研究*

劉 留，徐文芬，何順志，張?zhí)靷?/p>

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

肉莢云實(shí)CaesalpiniadigynaRottle為豆科Leguminosoe云實(shí)屬CaesalpiniaL.植物，主要分布于南亞一帶的印度、越南、馬來(lái)西亞以及中國(guó)大陸的海南、云南等地，多生長(zhǎng)于海拔500 m左右的山坡灌叢中和海邊。通過(guò)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，云實(shí)屬的植物中含有萜類、黃酮類、生物堿、單寧、氨基酸等多種化學(xué)成分，多具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗瘧疾等藥理作用，但是其質(zhì)效關(guān)系尚不明確。為更好的對(duì)肉莢云實(shí)進(jìn)行深入的藥理研究以及對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，我們對(duì)肉莢云實(shí)果殼所含化合物進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。本實(shí)驗(yàn)報(bào)道從肉莢云實(shí)果殼乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分離、鑒定得到10個(gè)化合物，分別為(1)4’-羥基二氫黃酮、(2)甘草素、(3)β-谷甾醇、(4)熊果酸、(5)沒(méi)食子酸乙酯、(6)沒(méi)食子酸甲酯、(7)沒(méi)食子酸、(8)鞣花酸、(9)對(duì)二沒(méi)食子酸、(10)胡蘿卜苷。其中化合物(1)為首次從云實(shí)屬植物中提取得到，其余均首次從本植物中分離得到。

1 材料

1.1 儀器

XT-4型雙目顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公司)；JEOL ECX-500核磁共振波譜儀(日本電子株式會(huì)社)，TMS為內(nèi)標(biāo)物；5973 MSD質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；VECTOR22傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)BRUKER儀器公司)；HP8453紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)惠普公司)。薄層用硅膠GF254及柱層析硅膠均為青島海洋生化試劑廠生產(chǎn)。所用試劑均為分析純。

1.2 樣品來(lái)源

肉莢云實(shí)由作者采摘自海南三亞，由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為豆科云實(shí)屬植物肉莢云實(shí)Caesalpiniadigyna的果實(shí)，曬干，去籽。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取干燥肉莢云實(shí)果殼粗粉18.6 kg，以2倍量95%乙醇冷浸提取兩次，每次72 h。提取后的殘?jiān)?倍量95%乙醇超聲提取(40 kHz)兩次，每次30 min。合并提取液，減壓濃縮后得到總浸膏。將總浸膏用水分散后，依次使用石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯以及正丁醇萃取?；厥杖軇┖?，取乙酸乙酯浸膏630 g，經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯=9∶1→0∶1梯度洗脫，TLC檢測(cè)后合并主斑點(diǎn)一致或相近的流分，最后共得到13個(gè)流分。

取流分1、2、3，均使用正相硅膠柱色譜純化，分別以石油醚∶丙酮 = 9∶1、8∶1以及石油醚∶乙酸乙酯 = 4∶1洗脫，所得化合物在甲醇溶液中重結(jié)晶，得到化合物1、2和3。流分4使用正相硅膠柱色譜分離，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(1∶0，9∶1，6∶1)，得到兩個(gè)亞流分，分別用甲醇溶解，重結(jié)晶，得到化合物4以及化合物5。流分6使用適量丙酮加熱溶解后，緩慢滴加氯仿至剛出現(xiàn)沉淀，放置重結(jié)晶后得到化合物6。流分9使用制備薄層色譜分離，氯仿∶甲醇 = 5∶1展開，每2毫升展開劑滴加1滴甲酸，色帶2經(jīng)氯仿重結(jié)晶后得到化合物7。流分10使用正相硅膠柱色譜分離，石油醚∶丙酮梯度洗脫(6∶1→3∶1)，收集第二亞流分在丙酮-氯仿溶液中重結(jié)晶，得到化合物8。流分11濃縮后析出土黃色無(wú)定型沉淀，過(guò)濾收集沉淀得到化合物9。流分13使用正相硅膠柱色譜純化，氯仿∶甲醇 = 9∶1，每100毫升滴加4滴甲酸洗脫，所得化合物經(jīng)丙酮溶解，滴入氯仿過(guò)飽和后得到化合物10。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：為黃色針晶(甲醇)，熔點(diǎn)182～184 ℃，鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性。易溶于氯仿、甲醇。KBr壓片IR顯示在1665 cm-1處有吸收，證明其含有羰基；ESI-MS m/z：240；EI-MS m/z：223[M-OH]+，211[M-CHO]+，77[C6H5]+，91[C7H7]+，以上可判斷出該化合物為帶有取代基的苯環(huán)以及酚性結(jié)構(gòu)，104[C6H4+CO]+，136[M-C7H4O]+，124[M-C7H4O-H2O]+，114[M-C7H4O-CO]+，163[M-C6H5]+，據(jù)此可以推斷，該化合物結(jié)構(gòu)應(yīng)該有兩個(gè)苯環(huán)，一個(gè)帶有酚羥基，而另一個(gè)帶有的CO根據(jù)IR顯示應(yīng)該為羰基，初步估計(jì)為黃酮類化合物。

1H-NMR(500 MHz，CDCl3+acetone-d6)δ：5.55 ppm(1H，dd，Jcis= Ca.5 Hz，Jtrans=Ca.11 Hz，H-2)，2.78 ppm(2H，q，J偕=17 Hz，J鄰=5 Hz，H-3)，推斷其可能為二氫黃酮類化合物；9.35 ppm(1H，s，4’-OH)，6.45 ppm(1H，d，J = 8.4 Hz，3’，5’-H)，7.30～7.50 ppm(3H，c，6，2’，6’-H)，6.57 ppm(1H，dd，J = 1.9 Hz，8-H)，7.51(1H，d，J = 8.6 Hz，5-H)以及7.76(1H，t，7-H)。

13C-NMR(125 MHz，CDCl3+acetone-d6)呈現(xiàn)13個(gè)碳原子信號(hào)，推測(cè)有對(duì)稱結(jié)構(gòu)導(dǎo)致信號(hào)重疊；DEPT譜顯示沒(méi)有甲基信號(hào)但有1個(gè)亞甲基，4個(gè)未被增益的季碳原子；δ44.19 ppm(C-3)為DEPT譜上所顯示的亞甲基信號(hào)，推測(cè)其為二氫黃酮C環(huán)上的3位碳原子信號(hào)；4個(gè)季碳原子分別為：δ190.32 ppm(C-4)推測(cè)為因氧原子和苯環(huán)而強(qiáng)烈移向低場(chǎng)的C環(huán)上4位的苯甲酰碳原子，δ164.65 ppm(C-4’)與δ163.50 ppm(C-9)推測(cè)為B環(huán)上帶羥基的4’位碳及A環(huán)上帶醚鍵的9位碳，δ139.05 ppm(C-10)推測(cè)為連有羰基的10位碳原子信號(hào)；δ103.02 ppm(C-3’，C-5’)以及δ126.13 ppm(C-2’，C-6’)各為2個(gè)碳原子信號(hào)重疊，推測(cè)為因?qū)ξ浑p取代而呈對(duì)稱結(jié)構(gòu)的B環(huán)上的碳原子信號(hào)，δ128.81 ppm(C-1’)推測(cè)為B環(huán)與C環(huán)相連的1’位碳原子信號(hào)；δ110.79 ppm(C-8)，δ128.49 ppm(C-6)，δ128.63 ppm(C-7)，δ114.08 ppm(C-5)為A環(huán)上剩余碳原子信號(hào)。根據(jù)以上光譜數(shù)據(jù)可以推斷得到，該化合物為4’-羥基二氫黃酮(4'-hydroxyflavanone)，該化合物首次從云實(shí)屬植物中分離得到。

化合物2：為黃色針晶(甲醇)，熔點(diǎn)196～198 ℃。ESI-MS m/z：256，EI-MS m/z：255[M-H]+，239[M-OH]+，163[M-C6H5]+，91[C7H7]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3+acetone-d6)δ：5.49 ppm(1H，dd，Jcis=Ca.5 Hz，Jtrans=Ca.11 Hz，H-2)，3.01 ppm(2H，q，J偕=17 Hz，J鄰=5 Hz，H-3)推斷其可能為二氫黃酮類化合物；其譜圖與化合物(1)大致相同。13C-NMR(125 MHz，CDCl3+acetone-d6)譜也與化合物(1)相似，DEPT譜δ164.20 ppm出現(xiàn)第5個(gè)未被增益的季碳原子；其剩余碳譜數(shù)據(jù)：189.59 ppm(C-O)，162.71 ppm(C-8a)，157.20 ppm(C-4’)，128.91 ppm(C-1)，128.20 ppm(C-5)，128.00 ppm(C-2’)，127.80 ppm(C-6’)，115.10 ppm(C-5’)，115.00 ppm(C-3’)，110.20 ppm(C-6)，113.40 ppm(C-4a)，102.20 ppm(C-8)，79.20 ppm(C-2)，44.20 ppm(C-3)，以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[1]報(bào)道基本一致，推斷該化合物為甘草素(Liquiritigenin)。

化合物3：為白色針晶(乙酸乙酯)，熔點(diǎn)133～135℃，5%的硫酸乙醇下顯紫紅色，Liebermann - Burchard反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。易溶于氯仿、甲醇。EI-MS m/z：414[M]+，396 [M-H2O]+，55(環(huán)烯烴RDA反應(yīng)特征峰)以及255，213，145，107，81，69，43等甾醇化合物的特征離子峰。1H-NMR譜(500 MHz，CDCl3)與文獻(xiàn)[2]報(bào)道基本一致，故推斷該化合物為β-谷甾醇。

化合物4：為白色粉末(甲醇)，熔點(diǎn)280～283 ℃，5%的硫酸乙醇下顯紫紅色，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。1H-NMR譜 (500 MHz， pyridine-d5)與文獻(xiàn)[3]報(bào)道基本一致，并且該樣品使用TLC與熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，其Rf值與斑點(diǎn)顏色完全一致，確定該化合物為熊果酸。

化合物5：為白色粉末(乙酸乙酯)，熔點(diǎn)148～150 ℃。ESI-MS m/z：197[M-H]+；EI-MS m/z：153[C7H5O4]+，170[C7H6O5]+，125[C7H5O4-CO]+，79[C7H7]+。KBr壓片IR提示有成酯的羰基存在。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ：1.34 ppm(3H，t，J =7 Hz，-CH3)，4.28 ppm(2H，q，J = 7 Hz，O-CH2-)，7.16 ppm(2H，s)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道基本一致，確定該化合物為沒(méi)食子酸乙酯。

化合物6：為白色棱狀方晶(乙酸乙酯)，熔點(diǎn)201～203 ℃。EI-MS m/z：184[M]+，153[C7H5O4]+，139[M-OH-H2O]+，125[C7H5O4-CO]+，79[C7H7]+等沒(méi)食子酸特征碎片離子，提示該化合物可能為沒(méi)食子酸類衍生物。KBr壓片IR提示有成酯的羰基存在。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ：3.79 ppm(3H，s，O-CH3)，7.12 ppm(2H，s)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，確定該化合物為沒(méi)食子酸甲酯。

化合物7：為白色粉末(丙酮)，熔點(diǎn)238～240 ℃，溴酚藍(lán)反應(yīng)顯黃色，EI-MS m/z：170[M]+，153[M-OH]+，135[M-OH-H2O]+，142[M-CO]+，114[M-2CO]+，125[M-CO-OH]+，107[M-CO-OH-H2O]+，79[C6H7]+。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ7.10 ppm(2H，s)。13C-NMR(125 MHz，acetone-d6)δ：167.12 ppm(C-1)，109.80 ppm(C-3，C-7)，122.10 ppm(C-2)，138.11 ppm(C-5)，146.15 ppm(C-4，C-5)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，確定該化合物為沒(méi)食子酸。

化合物8：為白色方晶(丙酮)，ESI-MS m/z：323[M+1]+。EI-MS m/z：171，153，79。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ：7.09(2H，s)，7.26(2H， s)。13C-NMR(125 MHz，acetone-d6)δ：165.12 ppm(C=O’)，109.12 ppm(d，C-2’，C-6’)，145.12 ppm(s，C-3’，C-5’)，139.12 ppm(s，C-4’)，165.22 ppm(C=O)，128.02 ppm(s，C-1)，以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，確定該化合物為對(duì)二沒(méi)食子酸。

化合物9：為土黃色無(wú)定型粉末(甲醇)，微溶于甲醇，易溶于二甲亞砜，熔點(diǎn)大于360 ℃。EI-MS m/z：302[M]+，284[M-H2O]+，273[M-CHO]+，256[M-CO-H2O]+，246[M-2CO]+，228[M-2CO-H2O]+，218[M-3CO]+，190[M-4CO]+，77[C6H5]+；151[C7H3O4]+以及172[C7H8O5]+為沒(méi)食子酸結(jié)構(gòu)特征碎片。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.34 ppm(2H，s，H-4，H-9)，10.65 ppm(1H，s，-OH)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：159.50 ppm，148.10 ppm，139.58 ppm，110.20 ppm，136.38 ppm，112.30 ppm，108.60 ppm。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，確定該化合物為鞣花酸，即聯(lián)二沒(méi)食子酸內(nèi)酯。

化合物10：為白色粉末(甲醇)，5%硫酸-乙醇下顯紫紅色，放置后變灰綠色，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)呈陽(yáng)性。熔點(diǎn)292～294 ℃。其1H-NMR數(shù)據(jù)與13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]上的報(bào)道基本一致，且與對(duì)照品胡蘿卜苷在TLC上的Rf值以及顯色情況完全一致，因此確定該化合物為胡蘿卜苷。

3 討論

本研究所得最多的化合物為沒(méi)食子酸及其衍生物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，云實(shí)屬植物中特征性成分為卡斯烷型二萜以及高異黃酮類化合物居多。近年來(lái)一些英國(guó)學(xué)者從大托葉云實(shí)Caesalpiniacrista中分離得到5個(gè)新的呋喃并卡斯烷(furanocassane)型二萜類化合物還分得2個(gè)新的去甲卡斯烷型二萜化合物norcaesalpinin D和E，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者從小葉云實(shí)Caesalpiniamillettii中分離得到高異黃酮類化合物如怪柳黃素-3-O-(6″-O-E-咖啡?；?-β-D-半乳糖苷，8-methoxyisobonducellin等。本實(shí)驗(yàn)未能獲得二萜及高異黃酮，僅得一個(gè)二氫黃酮，可能是受提取藥材部位(果實(shí))的影響，目前對(duì)云實(shí)屬植物化學(xué)成分的研究，多以其根和地上部分，所以是否分離出高異黃酮和二萜與藥用部位之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。