黔產(chǎn)民族藥骨碎補藥材HPLC指紋圖譜研究*

高 月，黃春江，徐文芬，黃僑宗，吳付玉，肖仕林，林雨鑫

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，具有療傷止痛、補腎強骨的功效，用于治療跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛和筋骨痿軟等[1]?，F(xiàn)代研究表明骨碎補中化學(xué)成分主要有黃酮類、酚酸類、木脂素、甾體類及三萜類等；具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎、促進骨折愈合、促進牙齒生長、降血脂等作用[2]。目前，骨碎補藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價方法，除2015年版《中國藥典》一部收載骨碎補質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以柚皮苷作為藥材有效性控制的指標(biāo)成分外，文獻報道還有以柚皮苷、新北美圣草苷及其他指標(biāo)成分作為其質(zhì)量評價指標(biāo)[3-5]。然而，中藥的療效并非某一個或幾個成分作用的結(jié)果，建立符合中藥特點的質(zhì)量控制和評價方法是亟待解決的問題。中藥指紋圖譜能較全面地反映藥材所含化學(xué)成分的相對關(guān)系，能真正對中藥內(nèi)在質(zhì)量進行有效表征、綜合評價和全面控制[6-7]。本文采用高效液相色譜法，對12個不同批次的黔產(chǎn)骨碎補藥材進行指紋圖譜測定分析，從整體觀念出發(fā)，以多組分角度更客觀、更有效地反映該藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為骨碎補藥材的質(zhì)量綜合評價以及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)、AG135型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)、SB25-12DTD型超聲提取器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)等。

1.2 材料

柚皮苷對照品(批號：110722-201714，中國食品藥品檢定研究院)、新北美圣草苷(批號：BCY-001524，江西佰草源生物科技有限公司)；乙腈為色譜純(美國Tedia公司)，無水乙醇、甲醇、醋酸為分析純(均為天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，試驗用水為重蒸餾水。供試骨碎補藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為水龍骨科槲蕨DrynariaroosiiNakaike的干燥根莖，12批黔產(chǎn)樣品產(chǎn)地信息詳見表1。

表1 12批骨碎補樣本采集信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取新北美圣草苷0.5 mg、柚皮苷0.3 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，搖勻，即得對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取骨碎補藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷至室溫，用70%乙醇補足減失的重量，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.5%的醋酸水溶液(B)，采用梯度洗脫：0～10 min，2%～8%A；10～15 min，8%～15%A；15～22 min，15%～20%A；22～35 min，20%～22%A；35～45 min，22%～90%A；流速1.0 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 圖譜完整性考察

取供試品溶液制備的提取溶劑70%乙醇溶液，按2.3色譜條件下進樣檢測，結(jié)果顯示提取溶劑及流動相相對指紋圖譜測定沒有干擾。另取S9樣品(貴州惠水)，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3色譜條件下進樣檢測，考察指紋圖譜記錄的完整性，記錄45 min后以梯度結(jié)束時的流動相比例繼續(xù)洗脫，并記錄色譜圖至90 min，結(jié)果顯示50 min以后無色譜峰出現(xiàn)，故確定采集圖譜時間為45 min，結(jié)果見圖1。

2.4.2 精密度試驗

取S9(貴州惠水)樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液1份，按2.3色譜條件下進樣檢測，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以柚皮苷為參比峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.15%，各相對峰面積的RSD均小于1.5%，表明儀器的精密度良好。

圖1 指紋圖譜完整性考察結(jié)果Fig.1 Investigation results of fingerprint integrity

2.4.3 重復(fù)性試驗

取S9(貴州惠水)樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3色譜條件下進樣檢測，記錄色譜圖，以柚皮苷為參比峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.42%，相對峰面積的RSD均小于2.6%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取S9(貴州惠水)樣品1份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3色譜條件下分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h進樣檢測，記錄色譜圖，以柚皮苷為參比峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.28%，結(jié)果，相對峰面積的RSD均小于2.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測定

取12批骨碎補樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄測得的原始圖譜。

2.6 指紋圖譜的建立

將所得色譜圖分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)進行處理，以S9作為參照指紋圖譜，選擇中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，時間寬度設(shè)為0.50，對色譜峰進行全譜峰匹配，并生成對照指紋圖譜R，得到12批骨碎補藥材的HPLC指紋圖譜原始圖譜疊加圖及對照指紋圖譜R(圖2)。從12批藥材指紋圖譜共標(biāo)定10個共有峰，其中8號共有峰、9號共有峰的保留時間分別與新北美圣草苷對照品和柚皮苷對照品的保留時間一致，且其紫外吸收光譜也一致，因此，指認(rèn)8號共有峰為新北美圣草苷，9號共有峰為柚皮苷，并設(shè)定9號共有峰為參照峰，計算不同批次骨碎補指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間RSD在0.02%～0.23%之間，各共有峰的相對峰面積RSD在25.20%～126.31%之間，說明不同批次的骨碎補藥材化學(xué)成分相對含量存在較大差異，結(jié)果見圖3和表2、表3。

圖2 12批骨碎補藥材HPLC指紋圖譜原始圖譜疊加圖及對照指紋圖譜RFig.2 HPLC fingerprint，original fingerprint，superposition map，and control fingerprint R of the 12 batches of Drynariae Rhizoma

表2 12批骨碎補藥材10個共有峰的相對保留時間

表3 12批骨碎補藥材10個共有峰的相對峰面積

2.7 結(jié)果分析

2.7.1 相似度評價結(jié)果

采用指紋圖譜軟件對12批骨碎補藥材進行相似度評價的結(jié)果為：各批次樣品指紋圖譜的相似度范圍為0.551～0.957。由此可見，各批次骨碎補藥材的化學(xué)成分及其含量有一定差別，結(jié)果見表4。

表4 12批骨碎補藥材指紋圖譜相似度計算結(jié)果

2.7.2 聚類分析結(jié)果

將12批不同批次骨碎補藥材指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS20.0軟件進行聚類分析。運用組間連接法進行系統(tǒng)聚類分析，其中樣品間距離的計算采用歐式平方距離法，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示：當(dāng)判別條件距離為20時，大致分為三大類，S4(貴州省安龍縣)可單獨聚為一類；S3(貴州省興義市)、S6～S8和S11(貴州省遵義市)聚為一類；S1～S2、S5(貴州省獨山縣)、S9～S10、S12(貴州省仁懷市)聚為一類。

圖4 12批骨碎補藥材指紋圖譜聚類樹狀關(guān)系圖Fig.4 Cluster tree diagram of fingerprints of the 12 batches of Drynariae Rhizoma

2.7.3 主成分分析結(jié)果

采用SPSS20.0軟件，將12批骨碎補藥材指紋圖譜的10個共有峰峰面積原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù)，進行主成分分析，計算相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值、累積貢獻率并計算主成分綜合得分[8]，對12批骨碎補藥材進行評價。根據(jù)因子分析結(jié)果可得總方差解釋表，對各變量進行因子提取和因子旋轉(zhuǎn)的結(jié)果，見表5和圖5。

表5 骨碎補總方差解釋變異量

圖5 主成分分析碎石圖Fig.5 Principal component analysis gravel map

根據(jù)各因子特征值大于1的原則及因子的方差累計貢獻率達到85%以上作為主成分提取的標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合表4，本試驗需要提取的主成分主要有5個，其中提取主成分1的特征值為3.515，其貢獻率為35.147%；提取主成分2的特征值為2.268，貢獻率為22.676%；提取主成分3的特征值為1.256，貢獻率為12.562%；提取主成分4的特征值為0.951，貢獻率為9.508%；提取主成分5的特征值為0.862，貢獻率為8.618%。這5個主成分的累積方差總貢獻率達到88.511%，因此提取前5個主成分進行分析較為合適。進行正交旋轉(zhuǎn)，得到不同批次骨碎補10個指標(biāo)在5個主成分中的旋轉(zhuǎn)成分矩陣，見表6。

表6 黔產(chǎn)骨碎補旋轉(zhuǎn)成分矩陣

根據(jù)表5、表6，以Y1，Y2，Y3，Y4，Y5代表5個主成分來作為12批次骨碎補成分所表達的信息進行評價，得出如下成分的線性關(guān)系表達式分別為Y1=0.057F1-0.129F2+0.126F3-0.401F4+0.924F5+0.099F6+0.317F7+0.088F8+0.175F9+0.925F10，Y2=0.844F1+0.308F2-0.065F3+0.587F4+0.055F5-0.040F6-0.025F7-0.080F8-0.833F9-0.193F10，Y3=-0.186F1-0.112F2+0.096F3-0.289F4+0.364F5+0.360F6+0.697F7+0.934F8-0.210F9-0.034F10，Y4=0.123F1+0.849F2-0.115F3-0.230F4+0.002F5+0.899F6+0.147F7+0.090F8-0.213F9-0.049F10，Y5=0.146F1-0.155F2+0.897F3-0.449F4+0.039F5+0.053F6+0.459F7+0.001F8+0.307F9+0.208F10[9]。表達式中各變量不是原始變量，而是標(biāo)準(zhǔn)化變量。

將上述所得表達式，與所對應(yīng)的5個主成分的方差貢獻率做內(nèi)積，得到黔產(chǎn)骨碎補質(zhì)量綜合函數(shù)表達式：

Y綜合得分=(Y1×35.147+Y2×22.676+Y3×12.562+Y4×9.508+Y5×8.618)/88.511

根據(jù)以上表達式得到12批次骨碎補綜合得分值及排序，結(jié)果見表7。

表7 12批次骨碎補主成分得分及綜合得分排名

綜合得分越高，表明質(zhì)量越好[10-11]。12批黔產(chǎn)骨碎補綜合得分排名由高到低依次為S3，S8，S11，S6，S4，S2，S7，S5，S9，S10，S12，S1。當(dāng)選取第1、2、3個因子主成分分析，S1、S2、S9、S10相聚在一類，S3、S5、S6、S7、S8、S11聚為一類，S4、S12偏離較遠(yuǎn)，主成分分析與聚類分析、相似度評價結(jié)果基本一致，但其中S5在主成分分析與聚類分析兩種模式識別結(jié)果中的差異較大。結(jié)果見圖6。

圖6 選取第1、2、3個因子主成分分析結(jié)果Fig.6 Principal component analysis results of the first，second and third factor

3 討論

本文以指紋圖譜中主要色譜峰峰面積及色譜峰峰數(shù)為指標(biāo)，考察了不同提取方法(超聲、回流)、提取時間(15 min、30 min、45 min、60 min及75 min)、不同提取溶劑(70%甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇及90%乙醇)對結(jié)果的影響。最終確定骨碎補指紋圖譜測定的提取方法為40倍體積的70%乙醇超聲提取30 min一次。

對不同流動相(甲醇-0.1%醋酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%醋酸水、乙腈-0.5%醋酸水及乙腈-1%醋酸水)梯度洗脫考察結(jié)果表明，乙腈-0.5%醋酸水作為流動相峰形尖銳，分離度好且基線平穩(wěn)；不同色譜柱Accucore C18(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)、Hypersil GOLD(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)考察結(jié)果表明，Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱分離效果好；不同檢測波長(254 nm、260 nm、283 nm)比較結(jié)果表明，260 nm處色譜峰多且信息完全。因此，確定色譜條件以Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，檢測波長為260 nm，流動相為乙腈-0.5%醋酸水梯度洗脫。

通過對12批黔產(chǎn)骨碎補藥材樣品的指紋圖譜分析可知，其共有峰的相對保留時間差異較小，表明本文所建立的骨碎補藥材指紋圖譜測定方法重現(xiàn)性良好，但不同批次黔產(chǎn)骨碎補藥材相對峰面積差異較大，表明該藥材質(zhì)量受地域影響較大。研究結(jié)果為完善黔產(chǎn)骨碎補藥材的綜合質(zhì)量控制評價體系提供了數(shù)據(jù)參考。