貴州特色飲片醋炙荷葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

王先菊，李 瑋，杜洪志，吳珊珊，候曉杰，魏 晴，劉婭琴，張 敏

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

荷葉為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血等功效；可用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉，脾虛泄瀉，便血崩漏[1]等?，F(xiàn)代研究表明，荷葉有多種化學(xué)成分及藥理作用；化學(xué)成分包括黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類、三萜類、類固醇、酚酸類等[2-3]，其中，前兩者是其主要活性成分[4]，其藥理作用主要有降血脂、減肥作用[5-6]，抑菌作用[7]，抗驚厥作用，止血作用[8]，抗氧化作用[9]等。荷葉價格低廉，產(chǎn)量豐富，具有很好的前景，目前在2015版《中國藥典》中，只收載了荷葉以及荷葉炭，醋荷葉未見收載，缺乏其質(zhì)量控制方法，而醋炙荷葉又為貴州特色炮制方法，因此本研究對貴州特色炮制方法飲片醋炙荷葉進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為醋炙荷葉的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC-20AT型高效液相色譜儀)；萬分之一電子分析天平(ME204型上海梅特勒托利多儀器有限公司)；超聲波清洗機(HS10260D型天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2型常州奧華儀器有限公司)；鼓風(fēng)干燥箱(CS101-1C型重慶四達實驗儀器廠)；十萬分之一電子天平(AUW220D蘇州島津儀器有限公司)。

1.2 試劑

荷葉堿(CAS NO:475-83-2，純度：≥98，貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司)，乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜純)，水(杭州娃哈哈集團有限公司授權(quán)貴陽娃哈哈昌盛飲料有限公司制造)，冰醋酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)，三乙胺(天津市富宇精細化工有限公司)，甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜純)，乙醇(天津市富宇精細化工有限公司分析純)。

1.3 試藥

經(jīng)過實地采購和網(wǎng)上選購以及廠家提供，得到江西、浙江、廣西、河南、湖北、山東、廣東、貴州、四川、湖南等10個地方的藥材，藥材來源見表1，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室魏升華教授鑒別為睡蓮科Nymphaeaceae荷葉屬蓮NelumbonuciferaGaertn的干燥葉。醋炙荷葉飲片出自德昌祥的婦科再造丸，即：稱取適量荷葉于適宜容器內(nèi)，加入與荷葉質(zhì)量比例為100∶20的米醋，悶潤1 h，每0.5 h翻動一次，置炒制容器內(nèi)炒至近干，取出，放涼。

表1 藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 檢查

2.1.1 水分測定

照2015版《中國藥典》第四部通則0832項下“水分測定法”烘干法測定醋炙荷葉飲片的水分含量，對10批荷葉飲片及醋炙荷葉飲片進行測定，10批醋炙荷葉飲片水分范圍為4.39%～9.86%，平均值為7.17%。

2.1.2 總灰分測定

按照2015版《中國藥典》第四部通則2302項下“灰分測定法”測定醋炙荷葉飲片的灰分含量，對10批荷葉飲片及醋炙荷葉飲片進行測定，10批醋炙荷葉飲片灰分范圍為6.58%～9.51%，平均值為8.58%。

2.2 浸出物測定

照2015版《中國藥典》第四部通則2201項下“浸出物測定法”，以70%乙醇為溶劑，按熱浸法測定醋炙荷葉飲片的醇浸出物含量，對10批荷葉飲片及醋炙荷葉飲片進行測定，10批醋炙荷葉飲片浸出物范圍為8.52%～13.46%，平均值為10.56%。

2.3 荷葉堿測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱WondaSil C18-WR(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；以乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(27∶70.6∶1.6∶0.78)為流動相；檢測波長為270 nm；流速為1.000 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

2.3.2 對照品的制備

取荷葉堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含16 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品的制備

精取本品粗粉0.5 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察

取“2.3.2”項下配制的對照品，精密吸取對照品溶液0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件，分別進樣20 μL，記錄峰面積，以濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得Y=67103X-997.45(r= 0.9997)，結(jié)果表明荷葉堿呈良好線性關(guān)系，線性范圍為0.016～0.176 μg。

2.3.5 精密度實驗

取編號為SC2017072的荷葉的粉末，按要求提取，連續(xù)進樣6次，計算RSD值，測定荷葉堿的RSD值為2.5%，小于3%，說明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性實驗

精密稱取SC2017072的荷葉藥材粉末6份，每份0.5 g，按“2.3.3”項下制備供試品溶液，再按2.3.1項下色譜條件進行測定，測得RSD值為2.5%，說明重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實驗

取編號為SC2017072的荷葉，按“2.3.3”項下制備供試品溶液，將其置于避光的室內(nèi)，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h測定，測得荷葉堿平均峰面積的RSD值為2.45%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收實驗

稱取已知含量的生品荷葉(SC2017072)粉末(過2號篩)0.25 g，精密加入與0.25 g中荷葉中荷葉堿含量相同的對照品溶液(16 μg/mL)9.2 mL，測得回收率的范圍在96.05%～103.33%之間，且RSD值為2.9%，說明此方法可行。

2.3.9 樣品荷葉堿含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定含量結(jié)果見表2。

表2 荷葉堿的測定

續(xù)表2

產(chǎn)地樣品序號百分含量/%平均百分含量/%RSD湖南10.051620.04930.05130.05062.81%江西10.074220.075430.07520.0750.86%山東10.029920.031230.03140.03082.65%四川10.078420.077330.07910.07831.16%浙江10.050120.050230.05020.05020.14%

結(jié)果表明，10個批次醋炙荷葉飲片的荷葉堿含量范圍在0.0300%～0.0851%之間，含量平均值為0.06%。

3 結(jié)果與討論

本次實驗測定了江西、浙江、河南、湖北、廣東、四川、廣西、山東、貴州、湖南等產(chǎn)地10個批次荷葉的水分、灰分、浸出物、荷葉堿等項目。經(jīng)計算，各地區(qū)所產(chǎn)荷葉，經(jīng)醋炙后水分與生品比較大多有所減少，減少量在3%以上，分別是江西3.28%、浙江8.18%、河南3.08%、湖北3.62%、廣東3.57%、四川3.45%。而有3個地區(qū)水分減少在1%以下，分別是廣西0.95%、山東0.73%、貴州0.44%。另外湖南地區(qū)的水分含量略微增加，可能是該地區(qū)荷葉中含水量較少，在經(jīng)過醋的浸潤炒制后水分減少不明顯，而冷卻過程中有水汽的加入，從而使水分略微增加。總灰分的測定中，生品與醋炙品比較，炮制前后總灰分含量變化趨勢并不明顯，既有增加也有減少，可能因為荷葉的收集是在不同的時間和不同地區(qū)所收集的，因此，存在儲存時間長短的問題，儲存時間較長的荷葉有的有效成分慢慢減少，所以使灰分含量增加。浸出物的檢測中，江西、河南、湖北的含量增加，其余7個地區(qū)的含量減少，其原因可能是浸出物中含有多種成分，如生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類以及多糖和有機酸等成分，而炮制過程會使部分成分減少，從而使浸出物含量減少，另外在荷葉堿的檢測中，山東、四川、湖南、湖北地區(qū)含量增加，其余6個地區(qū)含量亦有減少，本次研究測定了炮制前后水分、總灰分、浸出物、指標(biāo)成分荷葉堿等含量的變化情況，有數(shù)據(jù)支持，可為貴州特色炮制方法醋炙荷葉飲片質(zhì)量控制提供參考。由于實驗不能詳細說明炮制影響各類成分變化的機理，因此有待進一步研究。

醋炙荷葉貴州特色炮制方法飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定：上限標(biāo)準(zhǔn)按平均值的20%上浮，建議醋炙荷葉貴州特色飲片的水分不超過8.61%，總灰分不超過10.30%，下限標(biāo)準(zhǔn)按平均值20%下浮，建議醇浸出物不得少于8.45%，荷葉堿含量不得少于0.05%。