黔產(chǎn)紅花龍膽藥材HPLC指紋圖譜及芒果苷含量分析*

劉恩穩(wěn)，徐仕娟，徐文芬，劉 嬌，馬敏龍，陳小秀，員 浬

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

紅花龍膽為2015年版《中國藥典》一部和2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種，是貴州少數(shù)民族常用藥物，又名青魚膽草(苗族藥名“銳定謀”)，來源于龍膽科龍膽屬多年生草本植物紅花龍膽GentianarhodanthaFranch.的干燥全草，性味苦寒，具有清熱燥濕、解毒瀉火、止咳的功效，主治濕熱黃疸、肺熱咳嗽、小便不利[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，紅花龍膽主要含酚酸類、(裂)環(huán)烯醚萜類、口山酮類、黃酮類、三萜類等化合物，且主要成分芒果苷，是發(fā)掘抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、止咳、抑菌等藥物的主要活性物質(zhì)，除此之外，其含量甚微的環(huán)烯醚萜苷類化合物在提取富集、含量測定和活性方面，近幾年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3-9]。由于紅花龍膽藥材多來源于野生，許多地區(qū)野生資源蘊(yùn)藏量急劇銳減，在民間各地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用中存在混用的現(xiàn)象，因此，加強(qiáng)紅花龍膽的質(zhì)量控制極其重要[10]。紅花龍膽作為肺力咳合劑、蓮龍膠囊、康婦靈膠囊等制劑的主要原料，需求量不斷增加，原料質(zhì)量是保障相關(guān)制劑安全有效和質(zhì)量可控的前提。在現(xiàn)行《中國藥典》紅花龍膽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，雖然已經(jīng)建立了以芒果苷為含量測定指標(biāo)的藥材質(zhì)量控制方法。但是，對于中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的中藥，產(chǎn)生的療效不是某一成分作用的結(jié)果，檢測任何一種活性成分均不能反映中藥所體現(xiàn)的整體療效。因此，從中醫(yī)藥整體作用出發(fā)，為較全面地表征紅花龍膽質(zhì)量屬性，本文采用高效液相色譜法，以黔產(chǎn)11批紅花龍膽藥材為研究對象，建立其指紋圖譜測定方法，結(jié)合多種模式識別方法進(jìn)行指紋圖譜分析評價，并比較其芒果苷的含量差異，以期為紅花龍膽藥材質(zhì)量的綜合評價及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate-3000型高效液相色譜儀、Thermochromeleon7色譜工作站(美國Thermo Fisher公司)，AG135型十萬分之一電子天平 (瑞士Mettler-Toledo公司)，KQ-500DE超聲器(昆山市超聲儀器有限公司)，DIKMA Diamonsil spusil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)等；2004 A版國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(以下簡稱指紋圖譜軟件)。

1.2 材料

芒果苷對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號 111607-201704，供含量測定用)，甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)，磷酸為優(yōu)級純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。11批黔產(chǎn)紅花龍膽藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為龍膽科植物紅花龍膽GentianarhodanthaFranch.的干燥全草，洗凈后50 ℃烘干粉碎，過三號篩備用，樣品采集信息見表1。

表1 11批紅花龍膽藥材信息

2 指紋圖譜方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

DIKMA Diamonsil spusil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～10 min，93%→89%B；10～33 min，89%→81%B；33～48 min，81%→72%B；48～57 min，72%→69%B；57～61 min，69%→63%B；61～77 min，63%→10%B)；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長242 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取芒果苷對照品適量，置10 mL容量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.072 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取紅花龍膽藥材粉末1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞并稱定質(zhì)量，超聲處理15 min(功率500 W，頻率40 kHz)，冷卻至室溫，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，濾液濃縮并轉(zhuǎn)移定容于10 mL容量瓶，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

精密吸取70%甲醇溶液、對照品及供試品溶液，微孔濾膜過濾，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖1。結(jié)果表明，該提取溶劑、流動相及色譜條件下，對指紋峰測定無干擾。

圖1 供試品(A)、對照品(B)和70%甲醇溶液(C)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of sample(A)，reference substance (B) and 70% methanol solution (C)

2.3.2 完整性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，按既定條件洗脫結(jié)束時的流動相比例繼續(xù)洗脫至154 min，記錄色譜圖2。結(jié)果顯示，按既定洗脫程序運(yùn)行77 min后未檢測到樣品色譜峰，表明采集77 min色譜圖可基本完整記錄紅花龍膽藥材化學(xué)成分信息。

圖2 紅花龍膽完整性試驗(yàn)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of integrity test ofGentiana rhodantha

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖并以芒果苷峰為參比峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，前者均<0.41%，后者均<1.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，于“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并以芒果苷峰為參比峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，前者均<0.10%，后者均<1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下分別在第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h進(jìn)樣測定，并以芒果苷為參比峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，前者均<0.59%，后者均<1.9%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

取11批紅花龍膽樣品供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將其原始圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件進(jìn)行相似度分析，以S1樣品為參照圖譜，采用中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.5，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動匹配后生成紅花龍膽的共有模式，得到11批紅花龍膽樣品的HPLC疊加圖譜，結(jié)果見圖3。

圖3 11批紅花龍膽藥材HPLC疊加圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of 11 batches of Gentiana rhodantha

2.5 共有峰的標(biāo)定及指認(rèn)

根據(jù)指紋圖譜匹配結(jié)果，標(biāo)定17個共有峰，經(jīng)過與相同條件測定的芒果苷對照品HPLC圖譜比較，供試品圖譜中7號共有峰的保留時間及UV光譜圖與芒果苷對照品色譜峰一致，且色譜峰的峰形和分離度較好(見圖4)，故設(shè)定7號共有峰為參照峰(S)，計算其余16個共有峰的相對保留時間和相對峰面積值。結(jié)果詳見表2、表3。

圖4 芒果苷對照品HPLC圖譜(A)及紅花龍膽對照指紋圖譜(B)Fig.4 HPLC spectrogram of mangiferin reference (A) and HPLC contrast fingerprint of Gentiana rhodantha (B)

表2 11批紅花龍膽藥材指紋圖譜17個共有峰的相對保留時間

表3 11批紅花龍膽藥材指紋圖譜17個共有峰的相對峰面積值Tab.3 Relative peak areas of 17 common fingerprintpeaks in 11 batches of Gentiana rhodantha

2.6 相似度評價結(jié)果

11批樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果見表4，其相似度結(jié)果為0.589～0.993，其中S1、S2、S6紅花龍膽指紋圖譜與其他批次指紋圖譜相似度較低，均小于0.8，其化學(xué)成分存在較大差異，但S1和S2指紋圖譜的相似性較高，相似度為0.984。其余批次紅花龍膽藥材指紋圖譜相似度相對較高，表明其化學(xué)成分具有一定的相似性。

表4 11批紅花龍膽藥材的相似度結(jié)果

2.7 聚類分析(HCA)結(jié)果

聚類分析是建立樣本與樣本之間相似關(guān)系或親疏關(guān)系的一種數(shù)據(jù)分析手段，目前已廣泛應(yīng)用于中藥鑒別、質(zhì)量評價和品種分類等方面[11-13]。以11批紅花龍膽藥材指紋圖譜中17個共有峰的峰面積為變量，利用SPSS 20.0軟件中“系統(tǒng)聚類”，結(jié)合“組間距離法”對紅花龍膽樣品HPLC指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，以歐氏距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，當(dāng)歐式距離為15時，11個產(chǎn)地的紅花龍膽主要分為3類，黔產(chǎn)有8批不同來源的紅花龍膽藥材被聚為一類(S1、S3～S5、S7～S10)，說明采集的紅花龍膽藥材不具有明顯的地域區(qū)分性；而S2和S11批藥材與其他批次分開，S6單獨(dú)成一類。該藥材聚類結(jié)果與相似度分析結(jié)果一致，可用于紅花龍膽藥材質(zhì)量的一致性評價。

圖5 聚類分析結(jié)果Fig.5 Results of hierarchical cluster analysis

2.8 主成分分析(PCA)結(jié)果

將11批紅花龍膽藥材的17個共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20. 0軟件，進(jìn)行PCA分析。對其原始數(shù)據(jù)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，進(jìn)行相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值及累積貢獻(xiàn)率的計算，各變量因子分析結(jié)果見表5、表6，碎石圖見圖6，并根據(jù)主成分綜合得分進(jìn)行排名。以特征值(VIP)>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前5個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為92.725%(>80%)，選取前5個主成分進(jìn)行分析，可反映紅花龍膽藥材中17個成分量的92.725%的信息量，具有很好的代表性，可用于評價紅花龍膽藥材的品質(zhì)。

表5 主成分特征值及方差

圖6 紅花龍膽藥材的碎石圖Fig.6 Scree plot of Gentiana rhodantha

表6 主成分載荷矩陣

主成分載荷矩陣可反映各變量對主成分的貢獻(xiàn)大小及方向，據(jù)因子載荷矩陣，可推測影響紅花龍膽藥材質(zhì)量差異的并不是單一成分，而是多成分作用的結(jié)果。由表6可知，17個變量對各主成分的正負(fù)相關(guān)，共有峰5、9和16對主成分1貢獻(xiàn)最大，共有峰2、3和17對主成分2貢獻(xiàn)最大，以此類推，可知共有指紋峰5、9～12、14和16號峰等對黔產(chǎn)紅花龍膽指紋圖譜差異的貢獻(xiàn)值較大。對比各共有峰，7號峰對不同產(chǎn)地紅花龍膽指紋圖譜差異的貢獻(xiàn)值較小，且其峰面積較大，適宜作為指紋圖譜的參照峰，說明本實(shí)驗(yàn)指紋圖譜的建立處所選取的參照峰合理。

以上述主成分載荷值建立紅花龍膽品質(zhì)的評價模型，用Z1、Z2、Z3、Z4、Z5代表前5個主成分反映貴州11批不同來源紅花龍膽藥材樣品所表達(dá)的信息，得出如下成分的線性組合表達(dá)式：

Z1=0.388X1+0.421X2+0.500X3+0.510X4+0.868X5+0.388X6+0.345X7+0.695X8+0.883X9+0.835X10+0.842X11+0.853X12+0.685X13+0.831X14+0.645X15+0.855X16+0.507X17

Z2=0.221X1+0.762X2+0.682X3+0.648X4-0.145X5-0.597X6-0.485X7+0.21X8-0.094X9-0.137X10-0.066X11-0.011X12-0.309X13-0.003X14+0.411X15-0.166X16-0.648X17

Z3=0.782X1-0.022X2+0.218X3+0.384X4+0.407X5-0.041X6+0.361X7-0.260X8+0.091X9-0.494X10-0.414X11-0.355X12-0.165X13-0.214X14-0.195X15+0.353X16+0.429X17

Z4=0.348X1-0.143X2+0.109X3+0.081X4+0.096X5+0.602X6-0.669X7-0.469X8-0.15X9-0.018X10+0.102X11-0.189X12+0.495X13+0.141X14+0.021X15-0.055X16-0.256X17

Z5=-0.105X1-0.379X2+0.427X3-0.230X4-0.052X5+0.151X6+0.130X7+0.248X8-0.379X9-0.001X10-0.297X11-0.290X12-0.110X13+0.331X14+0.509X15+0.205X16+0.005X17

其中，X為17個共有峰量化峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值。將上述所得表達(dá)式加合，構(gòu)建紅花龍膽藥材質(zhì)量綜合評價指標(biāo)，得到11批紅花龍膽藥材的主成分得分、綜合得分及排序情況，見表7，其中Z值越大，表明藥材的綜合質(zhì)量越高。11批不同產(chǎn)地紅花龍膽的綜合得分排名為：S6>S10>S8>S11>S2>S3>S9>

S7>S4>S5>S1。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地之間的紅花龍膽藥材化學(xué)成分含量存在一定的差異，且同一地區(qū)藥材質(zhì)量也并不統(tǒng)一。

表7 樣本主成分得分及排名

主成分1、2和3的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到76.050%，基本包含了紅花龍膽指紋圖譜的大部分信息，采用SPSS 20. 0軟件，以第1～3主成分得分(Z1～Z3)建立三維坐標(biāo)體系散點(diǎn)圖，見圖7。其中11批紅花龍膽樣品有8批的整體分布較近，說明該8批紅花龍膽藥材質(zhì)量差異不大，且樣品S6單獨(dú)聚為一類，其余樣品聚為一類，其PCA與HCA分析結(jié)果相互得以印證。

圖7 11批紅花龍膽藥材的三維散點(diǎn)圖Fig.7 Three-dimensional scatter plot of 11batches of Gentiana rhodantha

2.9 紅花龍膽中芒果苷的含量測定

依照2015年版《中國藥典》紅花龍膽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的芒果苷含量測定項下方法，色譜柱為Thermo Accucore C18(4.6 mm×150 mm，2.6 μm)，測定11批黔產(chǎn)紅花龍膽藥材中芒果苷的含量，結(jié)果見表8。

表8 不同批次紅花龍膽藥材中芒果苷的含量測定結(jié)果(n=3)

由表8可知，貴州不同產(chǎn)地紅花龍膽的芒果苷含量具有一定差異，其含量波動范圍較大(1.13%～2.85%)，其中貴州貴陽烏當(dāng)區(qū)和花溪區(qū)、龍里縣草原鄉(xiāng)、水城縣滴水巖村產(chǎn)地紅花龍膽藥材中芒果苷含量高于2.0%，符合現(xiàn)行《中國藥典》規(guī)定，其余采自貴州的7批野生樣品均不合格且含量差異較大，但貴州有不少藥物的主要原料是紅花龍膽，因此選擇適宜的區(qū)域?qū)t花龍膽藥材進(jìn)行規(guī)范化種植尤為重要，以保證該藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性，進(jìn)而確保相關(guān)中藥制劑的有效性。

3 討論

指紋圖譜色譜條件的優(yōu)化，由于紅花龍膽中主要含酚酸類、(裂)環(huán)烯醚萜類、口山酮類等化合物，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)分別考察了232、238、240、242、243、258、270、300 nm等8個波長，對比不同檢測波長下色譜峰容量差異，發(fā)現(xiàn)在242 nm條件下色譜峰信息較多，基線平穩(wěn)，因此選擇該波長為檢測波長。并考察了不同流動相(甲醇-水溶液，乙腈-水溶液、乙腈-0.02%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液)、色譜柱(DIKMA Diamonsil spusil-C18、Thermo Accucore-C18、Thermo Hyperil GOLD-C18)、柱溫(25 ℃、30 ℃)等，比較不同條件下色譜峰容量、峰形、響應(yīng)值和分離度情況，確定其最優(yōu)色譜條件，以全面反映紅花龍膽指紋圖譜中豐富的化學(xué)信息。此外，本實(shí)驗(yàn)對其提取方法(超聲、回流、冷浸)、提取溶劑(水；50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇和乙醇)、提取溶劑比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取時間(15 min、30 min、45 min、60 min)及提取次數(shù)(1次、2次、3次)進(jìn)行考察，除依據(jù)上述指標(biāo)外，從節(jié)約能源及操作簡單便捷考慮，最終確定提取溶劑比為1∶40，用70%甲醇溶液超聲提取15 min，提取1次為本次實(shí)驗(yàn)的提取條件。

本實(shí)驗(yàn)采用相似度評價、聚類分析和主成分分析對11批紅花龍膽樣品指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，結(jié)果基本一致，建立了樣品分類模型，S2和S11歸為一類，S6單獨(dú)分為一類，剩余8個批次的樣品歸為一類。結(jié)果表明紅花龍膽藥材的化學(xué)成分組成較為相似，但各批次之間成分的含量存在差異。所建立的紅花龍膽指紋圖譜分析方法重復(fù)性良好，可用于該藥材的綜合質(zhì)量評價，指紋圖譜結(jié)合有效成分的含量測定能夠較為直觀、準(zhǔn)確地反映不同產(chǎn)地紅花龍膽化學(xué)成分的變化情況，從整體上反映了該藥材的質(zhì)量，為紅花龍膽藥材綜合質(zhì)量控制和質(zhì)量評價提供了理論依據(jù)。根據(jù)本文測定的不同產(chǎn)地紅花龍膽中芒果苷含量和指紋圖譜的結(jié)果，與相關(guān)文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致，環(huán)境因子可能是影響紅花龍膽藥材品質(zhì)形成的主導(dǎo)因子，有待深入研究[14-17]。