杜仲葉中黃酮類化學成分研究△

閆建昆，張翔宇，石旭柳，丁麗琴*，邱峰*

1.天津中醫(yī)藥大學 中藥學院，天津 301608；2.河北農(nóng)業(yè)大學 理工系，河北 滄州 061100

1 材料

ARX-400型核磁共振儀(德國Bruker公司)；5500 QTRAP型三重四級桿液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國AB Sciex 公司)；e2695分析型高效液相色譜儀、2535制備型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Sepacore型中壓制備色譜(瑞士Buchi公司)；C18分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、C18制備型色譜柱(250 mm×20 mm，5 μm)均購于日本YMC公司；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20凝膠 (瑞典Pharmacia公司)；所用試劑均為分析純(天津康科德試劑公司)。

杜仲葉于2014年購自保定市安國藥材市場，產(chǎn)地為湖南，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學張麗娟教授鑒定為杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥葉，留樣保存于天津中醫(yī)藥大學中藥學院。

2 提取與分離

杜仲葉藥材9.5 kg，粉碎后用7倍量80%的乙醇回流提取3次，每次2 h。將乙醇提取物濃縮至無醇味后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次。合并各萃取層濃縮，得到石油醚層、三氯甲烷層、乙酸乙酯層(70 g)、正丁醇層(180 g)。乙酸乙酯層萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脫，得到10個流分E1～E10。

合并E6和E7為E67(8.0 g)，經(jīng)反相ODS開放柱色譜分離，甲醇-水(2∶100→100∶0)梯度洗脫，得到10個流分E670～E679。E674(1.9 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到10個流分E6740～E6749。E6749(31.0 mg)經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水(55∶45)洗脫，得到化合物1(10.0 mg)和2(14.0 mg)。E675(550.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到10個流分E6750～E6759和化合物3(161.0 mg)。E6757(29.0 mg)經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水(60∶40，含0.1%甲酸)洗脫，得到化合物4(20.1 mg)。

E8(30 g)經(jīng)聚酰胺開放柱色譜分離，乙醇-水(1∶100→100∶0)洗脫，得到8個流分E81～E88。E86(3.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到6個流分E861～E866。E864(230.0 mg)經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水(50∶50)洗脫，得到化合物5(18.0 mg)、6(11.0 mg)、7(7.0 mg)和8(24.0 mg)。E87(4.6 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)洗脫，得到6個流分E871～E876。E874經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到6個流分E8741～E8746。E8742經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水(80∶20，含0.1%甲酸)，得到化合物9(2.5 g)。

E9(10 g)經(jīng)反相ODS開放柱色譜分離，甲醇-水(5∶100→100∶0)洗脫。得到5個流分E91～E95，其中E92和E93合并為E923 (640.0 mg)，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到8個流分E9231～E9238。E9237(210.0 mg)經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水(25∶75)洗脫，得到化合物10(80.0 mg)。

E10(5.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到7個流分E101～E107。其中的流分E104(90.0 mg)經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水(40∶60)洗脫，得到化合物11(6.0 mg)。

正丁醇層萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脫，得到8個流分B1～B8。B8(24 g)經(jīng)反相ODS柱色譜分離，甲醇-水(1∶50→100∶0)梯度洗脫，得到17個流分B8-1～B8-17。B8-7經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到7個流分B8-7-1～B8-7-7，B8-7-5(105 mg)經(jīng)制備液相分離，甲醇-水(30∶70)洗脫，得到化合物12(16.1 mg)和13(8.0 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色固體粉末(甲醇)，分子式為C15H12O6。電噴霧離子源-質(zhì)譜法(ESI-MS)m/z：287.07[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.92(1H，s，H-2′)，6.79(2H，s，H-5′，6′)，5.89(1H，s，H-8)，5.88(1H，s，H-6)，5.27(1H，dd，J=1.8，2.6 Hz，H-2)，3.06(1H，dd，J=17.1，12.8 Hz，H-3)，2.69(1H，dd，J=17.1，2.7 Hz，H-3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：197.8(C-4)，168.5(C-7)，165.5(C-5)，164.9(C-9)，147.0(C-4′)，146.6(C-3′)，131.9(C-1′)，119.3(C-6′)，116.4(C-5′)，114.8(C-2′)，103.4(C-10′)，96.3(C-8)，80.6(C-2)，44.2(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物1為圣草素[13]。

化合物2：黃色固體(甲醇)，分子式為C15H12O5。ESI-MSm/z：271.07[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.32(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.82(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，5.90(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.88(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.34(1H，dd，J=12.9，2.8 Hz，H-2)，3.11(1H，dd，J=17.1，12.9 Hz，H-2)，2.70(1H，dd，J=17.1，2.9 Hz，H-3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：197.9(C-4)，168.6(C-8)，165.1(C-6)，159.2(C-4′)，131.3(C-1′)，129.2(C-2′，6′)，116.5(C-3′，5′)，103.5(C-10)，97.2(C-7)，165.0(C-5)，96.3(C-9)，80.6(C-2)，44.2(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物2為柚皮素[13]。

化合物3：黃色固體(甲醇)，分子式為C15H10O6。ESI-MSm/z：285.05[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.07(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.90(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.38(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：177.5(C-4)，165.7(C-7)，162.6(C-5)，160.7(C-4′)，158.4(C-9)，148.2(C-2)，137.3(C-3)，130.8(C-2′，6′)，123.9(C-1′)，116.4(C-3′，5′)，104.7(C-10)，99.4(C-6)，94.6(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物3為山柰素[14]。

化合物4：黃色固體粉末(甲醇)，分子式為C15H10O5。ESI-MSm/z：269.05[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.96(1H，s，5-OH)，7.92(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.92(2H，d，J=8.7 Hz，H-3′，5′)，6.78(1H，s，H-3)，6.48(1H，d，J=1.9 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：181.7(C-4)，164.1(C-2)，163.7(C-7)，161.4(C-9)，161.1(C-4′)，157.3(C-5)，128.4(C-2′，6′)，121.1(C-1′)，115.9(C-3′，5′)，103.7(C-10)，102.8(C-3)，98.8(C-6)，93.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物4為洋芹素[15]。

化合物5：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C22H22O10。ESI-MSm/z：431.11[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.69(1H，s，OH-5)，7.81(2H，d，J=8.1 Hz，H-2′，6′)，6.94(2H，d，J=8.1 Hz，H-3′，5′)，6.48(1H，s，H-8)，6.27(1H，s，H-6)，5.35(1H，s，H-1″)，4.03(1H，s，H-2″)，3.51(1H，dd，J=8.8，3.1 Hz，H-3″)，3.16～3.22(2H，m，H-4″，5″)，0.84(3H，d，J=5.1 Hz，H-6″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：178.2(C-4)，164.7(C-7)，161.7(C-5)，160.4(C-4′)，157.7(C-9)，156.9(C-2)，134.6(C-3)，131.0(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.8(C-3′，5′)，104.6(C-10)，102.2(C-1″)，99.2(C-6)，94.2(C-8)，71.6(C-4″)，71.1(C-3″)，70.8(C-2″)，70.5(C-5″)，17.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物5為山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷[16]。

化合物6：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C21H20O11。ESI-MSm/z：449.10[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.61(1H，s，OH-5)，8.04(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.1 Hz，H-3′，5′)，6.43(1H，s，H-8)，6.21(1H，s，H-6)，5.46(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，3.07～3.58(6H，m，H-2″～6″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.9(C-4)，164.6(C-7)，161.7(C-4′)，160.4(C-5)，156.8(C-9)，156.7(C-2)，133.6(C-3)，131.3(C-2′，6′)，121.4(C-1′)，115.6(C-3′，5′)，104.5(C-10)，101.3(C-1″)，99.1(C-6)，94.1(C-8)，78.0(C-5″)，76.9(C-3″)，74.7(C-2″)，70.4(C-4″)，61.3(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物6為紫云英苷[17]。

化合物7：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C20H18O10。ESI-MSm/z：419.09[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.58(1H，s，OH-5)，8.06(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.33(1H，s，H-6)，6.11(1H，s，H-8)，5.32(2H，d，J=5.1 Hz，H-1″)，3.74(1H，t，J=6.5 Hz，H-2″)，3.51～3.53(1H，s，H-3″)，3.65(1H，m，H-4″)，3.57(1H，dd，J=11.5，5.4 Hz，H-5″)，3.18～3.22(1H，dd，J=11.5，2.2 Hz，H-5″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.2(C-4)，164.2(C-7)，161.1(C-5)，160.1(C-4′)，156.5(C-2)，155.8(C-9)，133.4(C-3)，130.9(C-2′)，130.9(C-6′)，120.7(C-1′)，115.3(C-3′)，115.3(C-5′)，103.1(C-10)，101.3(C-1″)，99.3(C-6)，93.9(C-8)，71.6(C-3″)，70.8(C-4″)，66.0(C-2″)，64.2(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物7為山柰素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷[18]。

化合物8：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C23H22O12。ESI-MSm/z：491.11[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.56(1H，s，OH-5)，7.99(2H，d，J=8.3 Hz，H-3′，5′)，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.45(1H，s，H-8)，6.22(1H，s，H-6)，5.36(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，4.08～4.11(1H，m，H-6″)，3.93～3.97(1H，m，H-6″)，3.21～3.24(2H，m，H-2″，4″)，3.11～3.19(2H，m，H-3″，5″)，1.74(3H，s，6″-COCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.8(C-4)，170.3(C=O，-COCH3)，164.8(C-7)，161.6(C-5)，160.5(C-4′)，157.0(C-9)，156.8(C-2)，133.5(C-3)，131.3(C-2′，6′)，121.2(C-1′)，115.5(C-3′，5′)，104.3(C-10)，101.5(C-1″)，99.2(C-6)，94.2(C-8)，76.6(C-3″)，74.5(C-5″)，74.3(C-2″)，70.2(C-4″)，63.2(C-6″)，20.6(CH3，-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物8為山柰素-3-O-β-D-6′-乙酰基吡喃葡糖苷[19]。

化合物9：黃色固體(甲醇)，分子式為C15H10O7。ESI-MSm/z：303.04[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.49(1H，s，OH-5)，7.68(1H，d，J=2.2 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J=8.5，2.2 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J=8.5 Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：176.3(C-4)，164.4(C-7)，161.2(C-9)，156.6(C-5)，148.2(C-4′)，147.3(C-2)，145.5(C-3′)，136.2(C-3)，122.4(C-1′)，120.5(C-6′)，116.1(C-5′)，115.6(C-2′)，103.5(C-10)，98.7(C-6)，93.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物9為槲皮素[20]。

化合物10：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C21H20O11。ESI-MSm/z：449.10[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.65(1H，s，OH-5)，7.30(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.26(1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6′)，6.87(1H，d，J=8.3 Hz，H-5′)，6.39(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.26(1H，d，J=1.0 Hz，H-1″)，3.98(1H，s，H-2″)，3.51(1H，dd，J=8.8，3.1 Hz，H-3″)，3.22(1H，m，H-5″)，3.15(1H，t，J=9.0 Hz，H-4″)，0.82(3H，d，J=5.7 Hz，H-6″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：178.2(C-4)，164.7(C-7)，161.7(C-5)，157.7(C-9)，156.9(C-2)，148.9(C-4′)，145.7(C-3′)，134.7(C-3)，121.5(C-1′)，121.2(C-6′)，116.1(C-5′)，115.9(C-2′)，104.5(C-10)，102.3(C-1″)，99.2(C-6)，94.1(C-8)，71.6(C-4″)，71.0(C-3″)，70.8(C-2″)，70.5(C-5″)，17.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物10為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷[16]。

化合物11：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C26H28O16。ESI-MSm/z：597.13[M+H]；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.64(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.62(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.35(1H，s，H-8)，6.16(1H，s，H-6)，5.50(1H，d，J=7.3 Hz，H-1″)，4.76(1H，d，J=6.7 Hz，H-1?)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.4(C-4)，164.0(C-7)，161.1(C-5)，156.2(C-9)，155.3(C-2)，148.4(C-4′)，144.8(C-3′)，133.0(C-3)，121.9(C-6′)，121.2(C-1′)，116.0(C-5′)，115.2(C-2′)，104.5(C-1?)，103.9(C-10)，98.5(C-6)，97.9(C-1″)，93.4(C-8)，81.8(C-2″)，77.6(C-5″)，76.8(C-3″)，76.1(C-3?)，73.9(C-2?)，69.5(C-4?)，69.3(C-4″)，65.7(C-5?)，60.5(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物11為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃木糖苷[21]。

化合物12：黃色固體(甲醇)，分子式為C21H20O9。ESI-MSm/z：417.11[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.35(1H，s，H-2)，7.94(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，7.40(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.00(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.81(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，4.82(1H，d，J=9.6 Hz，H-1″)，4.03(1H，s，H-2″)，3.72(2H，m，H-5″，3″)，3.29～3.21(3H，m，H-4″，6″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：174.9(C-4)，161.1(C-7)，157.2(C-4′)，157.1(C-9)，152.6(C-2)，130.2(C-2′，6′)，126.2(C-5)，123.1(C-3)，122.5(C-1′)，116.8(C-10)，115.0(C-3′，5′，6)，112.7(C-8)，81.8(C-5″)，78.8(C-1″)，73.4(C-2″)，70.9(C-3″)，70.5(C-4″)，61.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致，鑒定化合物12為葛根素[22]。

化合物13：淡黃色固體(甲醇)，分子式為C21H20O9。ESI-MSm/z：417.11[M+H]；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.40(1H，s，H-2)，8.05(1H，d，J=8.9 Hz，H-5)，7.41(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.24(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，7.15(1H，dd，J=8.9，2.2 Hz，H-6)，6.82(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，5.11(2H，d，J=7.1 Hz，H-1″)，3.72(1H，m，H-2″)，3.47(2H，m，H-3″，5″)，3.35～3.28(2H，m，H-6″)，3.23～3.13(1H，m，H-4″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：174.8(C-4)，161.4(C-7)，157.3(C-9)，153.3(C-2)，130.1(C-2′，6′)，127.0(C-5)，123.7(C-3)，122.3(C-1′)，118.5(C-10)，115.6(C-6)，115.0(C-3′，5′)，103.4(C-1″)，100.0(C-8)，77.2(C-5″)，76.5(C-3″)，73.1(C-2″)，69.6(C-4″)，60.6(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物13為大豆苷[23]。