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    可可堿、茶堿和咖啡堿的快速測(cè)定及其色譜保留行為

    2019-10-29 06:38:56聶吉語(yǔ)湯書華姜子濤
    食品科學(xué) 2019年20期
    關(guān)鍵詞:甲醇溶液柱溫咖啡堿

    聶吉語(yǔ),李 榮,*,王 穎,湯書華,譚 津,包 榮,姜子濤,2,*

    (1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134;2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院,天津 301700)

    生物堿是一類于植物體內(nèi)廣泛存在的含氮雜環(huán)的堿性天然有機(jī)物,其中絕大部分具有重要的醫(yī)療價(jià)值[1-5]??煽蓧A、茶堿和咖啡堿是天然甲基黃嘌呤類生物堿,具有能夠使中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和骨骼肌興奮,血管達(dá)到舒張狀態(tài)、平滑肌得到松弛和利尿等生理作用[6]。三者母體結(jié)構(gòu)相同,但甲基取代基的位置和數(shù)目存在差異??煽蓧A與茶堿分別為3,7位和1,3位的二甲基取代,二者為同分異構(gòu)體,而咖啡堿為1,3,7位的三甲基取代。作為一類具有顯著生物活性作用的生物堿,可可堿、茶堿和咖啡堿普遍存在于茶葉、咖啡、可可和糖果等食品中[7-8]。近年來(lái),其制品在食品工業(yè)中更是得到了廣泛應(yīng)用,并且國(guó)標(biāo)中明確規(guī)定咖啡堿可用于可樂(lè)型飲料。但如果對(duì)以上3 種物質(zhì)的攝入量未加控制而過(guò)量食用,則會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用[9-11],因此建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)可可堿、茶堿和咖啡堿的方法非常必要。

    高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法是測(cè)定可可堿、茶堿和咖啡堿的最常用的方法[12-14],檢測(cè)一般采用C18反相色譜柱[15-18]。王增盛[19]采用μ Bondapak C18柱,以N-二甲基甲酰胺、甲醇、冰醋酸溶液為流動(dòng)相,同時(shí)測(cè)定了茶葉中的咖啡堿、茶堿和可可堿的含量;梁燕妮[20]采用C18柱,以甲醇和水為流動(dòng)相,梯度洗脫測(cè)定了不同廠家六堡茶中可可堿、茶堿、咖啡堿的含量;劉志彬等[21]采用Symmetry C18柱,以乙腈和乙酸溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫測(cè)定了10 種典型武夷巖茶葉片及沖泡茶湯中可可堿、茶堿和咖啡堿的含量;陳靜等[22]采用Unitary C18柱,以甲醇和0.5%甲酸溶液為流動(dòng)相,同時(shí)測(cè)定了可可堿和咖啡堿的含量。

    以上報(bào)道中雖可同時(shí)檢測(cè)1~3 種生物堿,但流動(dòng)相條件復(fù)雜,含有酸或鹽且需要調(diào)節(jié)pH值,以及需要梯度洗脫等。這些分離分析方法均建立在以硅膠為基質(zhì)的色譜柱基礎(chǔ)上,其游離的硅羥基會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附,可可堿、茶堿和咖啡堿等一些極性較強(qiáng)的生物堿色譜峰會(huì)嚴(yán)重拖尾,甚至?xí)驈?qiáng)吸附而不能洗脫[23],從而使分離效率降低,同時(shí)使色譜柱的使用壽命大幅縮短。而作為近年發(fā)展起來(lái)的新型色譜填料,鈦膠基質(zhì)固定相既可以作為L(zhǎng)ewis酸,也可以作為L(zhǎng)ewis堿,較傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)固定相優(yōu)勢(shì)明顯。并且其不存在硅膠固定相的“第2效應(yīng)”,同時(shí)在pH 1~14范圍內(nèi)均非常穩(wěn)定,對(duì)生物樣品中帶有磷酸基團(tuán)的物質(zhì)還具有特殊的吸附能力,分離選擇性也很高,而硅膠固定相則僅適用于pH 3~9的范圍內(nèi)。

    本實(shí)驗(yàn)采用鈦膠基質(zhì)色譜固定相建立的反相HPLC可同時(shí)分離,分析結(jié)構(gòu)相似的3 種生物堿——可可堿、茶堿和咖啡堿,該法流動(dòng)相成分簡(jiǎn)單且不含鹽,僅為5%甲醇溶液,且采用等度洗脫,檢測(cè)效率高、分離靈敏度高、檢出限低、穩(wěn)定性好。將此法應(yīng)用于6 種飲料樣品中可可堿、茶堿和咖啡堿的測(cè)定,在重復(fù)性、回收率等方面均表現(xiàn)優(yōu)異,結(jié)果令人滿意。另外,本實(shí)驗(yàn)也研究了3 種生物堿保留的熵、焓和吉布斯自由能,從熱力學(xué)的角度探討3 種生物堿在HPLC上的保留行為。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    可可堿標(biāo)準(zhǔn)品(99%)、茶堿標(biāo)準(zhǔn)品(99%)、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品(99%) 上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜級(jí)) 美國(guó)Sigma公司;6 種飲料樣品 市購(gòu)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1200系列HPLC儀 美國(guó)安捷倫公司;Sachtopore-RP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,300 ?) 美國(guó)Zirchrom公司;Lambda 25紫外-可見分光光度計(jì) 珀金埃爾默儀器有限公司;H2050R-1離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;AUY120萬(wàn)分之一天平 日本島津公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    1.0 mg/mL可可堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.100 0 g可可堿標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中;2.0 mg/mL茶堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.100 0 g茶堿標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水溶解并定容至50 mL容量瓶中;3.0 mg/mL咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.150 0 g咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水溶解并定容至50 mL容量瓶中,以上各儲(chǔ)備液均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 樣品處理

    飲料樣品:準(zhǔn)確量取5 mL已提前超聲脫氣20 min的樣品,稀釋2 倍,過(guò)0.45 μm微孔濾膜,進(jìn)行HPLC分析。固體飲料樣品:準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品,加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容,在60 ℃條件下采用超聲波提取30 min,隨后在4 000 r/min條件下離心10 min,上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜,進(jìn)行HPLC分析。

    1.3.3 色譜條件

    流動(dòng)相為水-甲醇(95∶5,V/V),等梯度洗脫;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm;柱溫60 ℃。

    1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    將可可堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至500、100、50、20、10 μg/mL和5

    μg/mL,茶堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至1 000、500、100、50、20、10 μg/mL和5 μg/mL,咖啡堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至1 200、600、120、60、24、12 μg/mL和6 μg/mL,取20 μL進(jìn)行HPLC分析,以各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液由上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液以相似水平配制而成,質(zhì)量濃度由低到高依次編號(hào)為1~7。

    1.3.5 熱力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

    參考文獻(xiàn)[23-25],并按照1.3.3節(jié)色譜條件分別在30、45、50、55 ℃和60 ℃測(cè)定可可堿、茶堿和咖啡堿的熱力學(xué)參數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 流動(dòng)相中甲醇比例的確定

    圖1 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液的HPLC圖Fig. 1 HPLC profiles with different proportions of methanol in mobile phase

    本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相僅為甲醇和水,配制甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為3%、5%、8%、10%和20%,按照1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,如圖1所示。隨著流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大,流動(dòng)相的極性變小,可可堿、茶堿和咖啡堿的保留時(shí)間也逐漸減小。保留時(shí)間短,雖然能夠使分析速度加快,但3 種生物堿的分離效果也會(huì)發(fā)生比較大的變化。當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為8%和10%時(shí),可可堿和茶堿的分離度減少,當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí),可可堿、茶堿和咖啡堿三者已經(jīng)不能實(shí)現(xiàn)完全分離。且它們的保留時(shí)間僅有4 min左右,較短的保留時(shí)間容易造成樣品制備過(guò)程中的雜質(zhì)、保留較弱的非極性或弱極性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。但當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)過(guò)低,僅為3%時(shí),咖啡堿的保留時(shí)間與前兩者相比又過(guò)長(zhǎng),浪費(fèi)分離時(shí)間,且存在溶質(zhì)峰展寬的現(xiàn)象。因此,最終選擇流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為5%,可達(dá)到各物質(zhì)在基線分離的情況下,保留時(shí)間相對(duì)較短。

    圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柱效的影響Fig. 2 Effect of methanol proportion in mobile phase on number of plates

    隨著流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大,半峰寬也隨之減小(圖1),在同一保留時(shí)間下,半峰寬越小,柱效越高[26-27]。如圖2所示,隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大,3 種堿的柱效也隨之增大;在同一甲醇體積分?jǐn)?shù)下,柱效由大到小為茶堿>咖啡堿>可可堿。

    2.2 柱溫的影響

    2.2.1 柱溫的選擇

    圖3 不同柱溫HPLC圖Fig. 3 HPLC profiles at different column temperatures

    按照1.3.3節(jié)色譜條件,分別調(diào)節(jié)柱溫為30、45、50、55 ℃和60 ℃進(jìn)樣分析,如圖3所示。柱溫對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿3 種物質(zhì)的保留時(shí)間和分離度也有較大的影響,但柱溫對(duì)三者的影響稍低于流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的影響。隨著柱溫的升高,3 種物質(zhì)的保留時(shí)間也越來(lái)越小,可可堿和茶堿的保留時(shí)間減小幅度不大,咖啡堿的保留時(shí)間減少明顯,說(shuō)明它們?cè)阝伳z反相色譜柱上的保留過(guò)程是放熱的,且熱效應(yīng)也有所不同。同時(shí),增加柱溫可以減小柱壓,峰形變好,在60 ℃以上,鈦膠柱更能發(fā)揮其優(yōu)良的色譜性能,然而甲醇的沸點(diǎn)(64.5 ℃)限制本研究最終選擇柱溫為60 ℃而不宜更高。

    圖4 柱溫對(duì)柱效的影響Fig. 4 Effect of column temperature on number of plates

    隨著柱溫的升高,可可堿、茶堿和咖啡堿的半峰寬呈減小趨勢(shì),表明柱效不斷提高。如圖4所示,隨著柱溫的升高,3 種堿的柱效也隨之增大;在同一柱溫下,柱效由大到小為茶堿>咖啡堿>可可堿。

    2.2.2 熱力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

    圖5 不同柱溫可可堿、茶堿和咖啡堿的Van’t Hoff曲線Fig. 5 Van’t Hoff plots for theobromine, theophylline and caffeine at different column temperatures

    表1 可可堿、茶堿和咖啡堿的回歸參數(shù)Table 1 Regression parameters for theobromine, theophylline and caffeine

    按照1.3.5節(jié)方法在30~60 ℃條件下對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿進(jìn)行分析,如圖5和表1、2所示。由圖5和表1可知,在不同溫度下,可可堿、茶堿和咖啡堿在鈦膠色譜柱上的分離效果呈現(xiàn)良好線性,表明在本實(shí)驗(yàn)所選定的溫度范圍內(nèi)其在鈦膠柱上具有一致的分離機(jī)制。

    表2 可可堿、茶堿和咖啡堿在333.15 K的熵、焓和吉布斯自由能Table 2 Standard entropy (ΔS0), enthalpy (ΔH0) and Gibbs free energy(ΔG0) of theobromine, theophylline and caffeine at 333.15 K

    鈦膠色譜柱對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿的分離是由ΔG0決定的,而ΔG0又與ΔH0和ΔS0有關(guān)。由表2可知,3 種生物堿的ΔH0和ΔS0均為負(fù)值,又根據(jù)文獻(xiàn)[25]可知:當(dāng)ΔG0為正值時(shí),表明主要由ΔS0來(lái)驅(qū)動(dòng)分析物的保留行為;當(dāng)ΔG0為負(fù)值時(shí),說(shuō)明此時(shí)ΔH0在它們的保留行為中起主要作用。

    熵代表了體系的混亂程度,當(dāng)分析物被固定相吸附時(shí)體系混亂度較小,因?yàn)榇藭r(shí)被吸附的物質(zhì)傾向于較整齊的排列;而當(dāng)分析物從固定相上解吸下來(lái)時(shí),此時(shí)被吸附的物質(zhì)趨向于做雜亂無(wú)章的布朗運(yùn)動(dòng),因此體系混亂度增大[28]。由表2可以看出,3 種生物堿吸附與解吸的總熵變?chǔ)0為負(fù)值,并且ΔS0的順序?yàn)椴鑹A<可可堿<咖啡堿,說(shuō)明在解吸過(guò)程中茶堿的混亂度減少最多導(dǎo)致其最不易被解吸,從熵變角度表明茶堿的吸附能力最強(qiáng),咖啡堿的吸附能力最弱,保留順序?yàn)榭Х葔A、可可堿、茶堿。

    焓代表了體系的熱效應(yīng),當(dāng)體系為吸熱過(guò)程,焓值升高;當(dāng)體系為放熱過(guò)程,焓值降低。由表2可以看出,3 種生物堿的總焓變?chǔ)0為負(fù)值,說(shuō)明溶質(zhì)在HPLC中的保留過(guò)程為放熱過(guò)程[29-30],即吸附的貢獻(xiàn)大于解吸的貢獻(xiàn),并且ΔH0的順序?yàn)榭Х葔A<茶堿<可可堿,從焓變角度表明咖啡堿的吸附能力最強(qiáng),可可堿的吸附能力最弱,保留順序?yàn)榭煽蓧A、茶堿和咖啡堿。

    當(dāng)分析物從流動(dòng)相進(jìn)入固定相為熱力學(xué)自發(fā)過(guò)程時(shí)ΔG0為負(fù)值,ΔG0越小,表明分析物越容易從流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到固定相中,即分析物在固定相上的保留會(huì)相對(duì)更強(qiáng)。可可堿、茶堿和咖啡堿的ΔG0均為負(fù)值,且依次減小,即咖啡堿在固定相中保留最強(qiáng),茶堿次之,可可堿保留最弱,這也說(shuō)明3 種堿在鈦膠固定相中的保留行為是由焓變?chǔ)0驅(qū)動(dòng)的,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明焓變的數(shù)值遠(yuǎn)大于熵變的數(shù)值,從熱力學(xué)角度闡明了分析物的保留機(jī)理。

    2.3 流速的選擇

    考察流速分別為0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min和1.4 mL/min時(shí)的影響,按照方法1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,如圖6所示。流動(dòng)相的流速對(duì)化合物的保留時(shí)間有較大影響。隨著流速的增大,可可堿、茶堿和咖啡堿的色譜峰前移,保留時(shí)間均縮短,同時(shí)其半峰寬也變小。而對(duì)于分離度而言,在5 種流速下,3 種生物堿均達(dá)到了完全分離,即分離度大于1.5。當(dāng)流速小于1.0 mL/min時(shí),保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng);但當(dāng)流速達(dá)到1.2 mL/min特別是1.4 mL/min時(shí),可可堿的保留時(shí)間偏小,同時(shí)在增大流速時(shí)會(huì)導(dǎo)致柱壓明顯增加,從而大大降低色譜柱的使用壽命,不利于色譜儀的正常使用。因此,流動(dòng)相的流速最終確定為1.0 mL/min。

    圖6 不同流速HPLC圖Fig. 6 HPLC pro fi les at different flow rates

    圖7 流速對(duì)柱效的影響Fig. 7 Effect of flow rate on number of plates

    同樣,在流速不斷增大的情況下,理論塔板數(shù)也不斷升高,即柱效呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。如圖7所示,在同一流速下,柱效由大到小為茶堿>咖啡堿>可可堿(1.4 mL/min除外);在流速為1.4 mL/min時(shí),可可堿和咖啡堿的柱效幾乎一致。

    綜合考慮以上因素,最終確定HPLC分離分析可可堿、茶堿和咖啡堿的最佳條件為流動(dòng)相水-甲醇(95∶5,V/V),柱溫60 ℃,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm,在此條件下三者混標(biāo)與單標(biāo)的HPLC圖見圖8。

    圖8 可可堿、茶堿和咖啡堿的HPLC圖Fig. 8 HPLC profiles of theobromine, theophylline and caffeine

    2.4 檢出限及線性范圍結(jié)果

    按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定可可堿、茶堿和咖啡堿的線性范圍。結(jié)果顯示,可可堿、茶堿和咖啡堿三者分別在質(zhì)量濃度范圍為5~500、5~1 000 μg/mL和6~1 200 μg/mL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,其回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表3所示。

    表3 可可堿、茶堿和咖啡堿的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients and LODs of theobromine, theophylline and caffeine

    2.5 方法精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

    從1.3.4節(jié)中選取3號(hào)和4號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在最優(yōu)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣9 次,計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即精密度小于0.23%。將可可堿、茶堿和咖啡堿加入需要測(cè)定的6 個(gè)飲料樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),如表4所示,6 種樣品的色譜圖見圖9。由表4可知,可可堿、茶堿和咖啡堿的回收率范圍分別為99.0%~102.0%、96.7%~106.7%和99.4%~102.3%。由圖9可知,本法可實(shí)現(xiàn)對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿的同時(shí)分離檢測(cè)。

    表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和回收率Table 4 Results and recoveries

    圖9 樣品HPLC圖Fig. 9 HPLC profiles of samples

    3 結(jié) 論

    鈦膠基質(zhì)色譜固定相在天然甲基嘌呤類生物堿如可可堿、茶堿和咖啡堿的快速、同時(shí)分析檢測(cè)中展現(xiàn)出了優(yōu)異的色譜性能,檢測(cè)結(jié)果顯示色譜峰峰形較好,可達(dá)到理想的測(cè)定效果,且其在線性范圍、檢出限以及加標(biāo)回收率等方面均可達(dá)到分析要求。此外,HPLC條件(尤其是流動(dòng)相)在較大程度上影響化合物的分離,流動(dòng)相的試劑種類、梯度比例以及酸溶液的種類和濃度均可影響分離效果。在本實(shí)驗(yàn)提出的色譜條件中,流動(dòng)相中甲醇的比例僅占5%,無(wú)需添加任何緩沖鹽,采用等度洗脫簡(jiǎn)便、快速。同時(shí),可以避免堿性物質(zhì)的不可逆吸附以及色譜柱的壽命隨使用而快速縮短等弊端,充分體現(xiàn)了綠色高效、保護(hù)環(huán)境、節(jié)約資源等優(yōu)點(diǎn),適于推廣普及。

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