基于高壓結(jié)合酶法制備的低敏蝦制品體內(nèi)體外致敏性檢測的差異性分析

王麗娟，胡志和，王星璇，李志清，羅夢娟，潘子檬，楊鈺娟，劉力鳳，劉 莉

（1.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

食物過敏是一種由食物引起的超敏反應(yīng)。報道顯示，成年人發(fā)生過敏反應(yīng)者約3%～4%，兒童則高達6%[1]。另一項研究顯示，2 歲以下嬰幼兒的食物過敏發(fā)生率由1999年的3.5%增加到2009年的7.7%，呈明顯上升趨勢[2]。在主要引起過敏的8 種（類）食物中[3]，水產(chǎn)品（魚以及蝦蟹在內(nèi)的甲殼類）占有重要一席。海蝦既是人們喜愛的食物之一，也是引起食物過敏的常見食物之一。食物過敏對人體的危害很大，可傷及機體各個系統(tǒng)和器官[4]，甚至發(fā)生過敏性休克而危及生命。因此，研究開發(fā)低敏或脫敏的蝦制品，在滿足人們食欲與營養(yǎng)的同時，可減少過敏的風險。目前，降解蝦過敏原的方法有多種，如酶解法、超高壓法等。為保證開發(fā)食品的安全性，對其過敏原的檢測必不可少。本實驗采用高壓結(jié)合酶法降解凡納濱對蝦的蝦蛋白、蝦仁泥（蝦肉）和蝦仁的過敏原，采用豚鼠過敏性休克模型和致敏離體回腸攻擊實驗檢測上述低敏蝦制品的致敏性，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測上述制品的過敏原水平，比較和分析動物模型實驗和體外檢測的差異性，明確動物實驗在過敏原檢測中的不可替代性。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

凡納濱對蝦（鮮） 天津市韓家墅水產(chǎn)市場。

英國種Hartly豚鼠（毛色為白色），雌雄各半，體質(zhì)量為220～240 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0004。

胰蛋白酶、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、吐溫-20、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗豚鼠IgG抗體（-80 ℃保存）美國Sigma公司；福林-酚 國藥集團化學試劑有限公司；丙酮（分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司；鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD，分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；海蝦過敏豚鼠血清（自制，-80 ℃保存）。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPPL2-800/2.5型超高壓設(shè)備 華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；Scientz-50N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SpectraMax 190型酶標分析儀 深圳市山特科技有限公司；UV-2100紫外分光光度計 尤尼克儀器有限公司；BL-420F生物信號采集系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓結(jié)合酶法制備凡納濱對蝦低敏蝦蛋白

將新鮮凡納濱對蝦去頭、尾、殼、腸線及筋膜后勻漿，將其與生理鹽水1∶1（g/mL，下同）混勻，預(yù)冷5 min后加入4 倍體積的丙酮（-20 ℃預(yù)冷過夜），充分混勻后于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，將沉淀物與4 倍體積冷丙酮混勻，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，重復(fù)操作直至上清液澄清，將沉淀物移至干凈濾紙上，分散自然風干，制成丙酮粉。將丙酮粉與KCl溶液（1 mol/L，含DTT 5 mmol/L）按1∶15（g/mL）混勻并抽提過夜。再次離心后收集上清液，沉淀物與KCl溶液混合繼續(xù)抽提4 h，4 ℃、4 000 r/min離心30 min，合并上清液得到蝦蛋白液，透析過夜后再凍干得到蝦蛋白，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

采用高壓結(jié)合胰蛋白酶處理蝦蛋白，采用福林-酚法[6]測試酶活力，找出保持胰蛋白酶活力的最佳壓力與保壓時間。在保持酶活性的高壓條件下，先探索高壓結(jié)合酶法處理蝦蛋白過敏原消減效果最好的底物質(zhì)量分數(shù)，再按已確定的最佳蝦蛋白濃度，找出蝦蛋白過敏原消減效果最好的酶加入量。

1.3.2 高壓結(jié)合酶法制備低敏蝦仁（蝦肉）制品

將新鮮凡納濱對蝦去除頭、尾、殼以及腸線、薄膜制成蝦仁，將蝦仁搗成肉泥即蝦肉。將蝦仁（蝦肉）與生理鹽水按不同比例混勻，加酶量為3 000 U/g（占底物質(zhì)量計）。之后與1.3.1節(jié)的步驟一致，逐步制成蝦仁（蝦肉）丙酮粉、蝦仁（蝦肉）蛋白液、蝦仁（蝦肉）蛋白，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用ELISA法檢測蝦仁（蝦肉）蛋白過敏原的消減效果，確定蝦仁（蝦肉）蛋白致敏性消減的最佳底物質(zhì)量分數(shù)。再按已確定的最佳底物質(zhì)量分數(shù)將蝦仁（蝦肉）與生理鹽水混勻，每個樣品加酶量不同，同樣工藝逐步制成蝦仁（蝦肉）丙酮粉、蝦仁（蝦肉）蛋白液、蝦仁（蝦肉）蛋白，將其置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用ELISA法檢測蝦仁（蝦肉）蛋白過敏原的消減效果，確定蝦仁（蝦肉）蛋白致敏性消減的最佳加酶量。

1.3.3 ELISA法檢測高壓結(jié)合酶法制備的低敏蝦制品過敏原的消減效果

根據(jù)1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)選定的最佳條件高壓結(jié)合酶處理蝦蛋白、蝦肉和蝦仁，各平行實驗3 次，將各產(chǎn)品平行實驗產(chǎn)物混勻，用ELISA法測定其過敏原，通過OD492nm值評價低敏制品過敏原的消減效果。

按間接ELISA法操作步驟進行[7]。包被抗原的工作質(zhì)量濃度50 μg/mL，酶標抗抗體（二抗）為兔抗豚鼠IgGHRP，底物選擇OPD。反應(yīng)終止后立即用酶標儀測定，在492 nm波長處測定各致敏豚鼠血清（1∶1 600稀釋）的OD值，每個樣品平行測定3 次，取平均值。

1.3.4 動物實驗檢測高壓結(jié)合酶法制備的低敏蝦制品過敏原的消減效果

1.3.4.1 豚鼠全身過敏性反應(yīng)檢測低敏蝦制品的致敏性

豚鼠在實驗室適應(yīng)1 周后，選出30 只健康合格的豚鼠按體質(zhì)量分層隨機分為5 組，每組6 只，雌雄各半。分組后進行初次致敏、致敏及觀察期滿進行激發(fā)。各組豚鼠的致敏方法與激發(fā)方法[8]見表1。

表1 豚鼠全身過敏反應(yīng)致敏與激發(fā)方法Table 1 Sensitization and stimulation of systemic anaphylaxis in guinea pig

激發(fā)時采取靜脈注射，如果不能一次注射成功，該例舍棄。激發(fā)后立即觀察并記錄1 h內(nèi)豚鼠的反應(yīng)，按表2觀察、評價豚鼠的過敏程度。

表2 豚鼠過敏反應(yīng)判定標準Table 2 Criteria for assessment of systemic allergic reaction in guinea pig

1.3.4.2 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏原攻擊實驗（Schultz-Dale反應(yīng)）檢測致敏性

合格豚鼠60 只，隨機分10 組，每組6 只，雌雄各半。1～5組用PBS致敏，6～10組用0.1%未處理的蝦蛋白致敏，各鼠腹腔注射，1.0 mL/只，隔日1 次，共3 次。末次注射后第14天進行Schultz-Dale反應(yīng)實驗。將致敏豚鼠斷頭處死，立即取出回腸一段，置于冷臺氏液（通氧）中備用。按離體器官裝置進行標本安裝并描記，浴管內(nèi)臺氏液（通O2，37 ℃）保持20 mL。待腸收縮平穩(wěn)后，用相應(yīng)物質(zhì)進行過敏原攻擊（各攻擊物的質(zhì)量濃度均為0.1 g/mL，加入量均為0.2 mL），觀察并記錄腸收縮曲線，比較各組腸管收縮變化率[9]，分析各高壓結(jié)合酶法制備的低敏蝦制品過敏原的消減效果。

式中：F1為攻擊前的腸平滑肌收縮力/g；F2為攻擊后的腸平滑肌收縮力/g。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓結(jié)合酶法降解凡納濱對蝦過敏原的工藝條件及其低敏制品過敏原體外檢測結(jié)果

采用間接ELISA法檢測各樣品的過敏原水平，以O(shè)D值的大小進行評價，對壓力、保壓時間、底物質(zhì)量分數(shù)、酶加入量等因素的影響進行比較，分析并確定了蝦蛋白、蝦肉、蝦仁過敏原降解的最佳工藝條件。按此條件進行重復(fù)實驗，測得OD值，以相應(yīng)原料為對照，計算低敏制品過敏原的消減效果，結(jié)果見表3。

表3 高壓結(jié)合胰蛋白酶處理凡納濱對蝦過敏原的條件及其結(jié)果Table 3 Conditions for treatment of allergens of Litopenaeus vannamei by high pressure combined with trypsin and corresponding allergen reduction

從ELISA檢測結(jié)果（表3）分析，經(jīng)高壓結(jié)合酶法處理的蝦蛋白、蝦肉和蝦仁的過敏原性分別消減97.0%、94.1%和94.5%。

2.2 高壓結(jié)合酶法制備的凡納濱對蝦低敏制品致敏性的在體檢測結(jié)果

2.2.1 豚鼠全身過敏反應(yīng)（過敏性休克模型）

以PBS、未處理蝦蛋白進行致敏，通過豚鼠過敏性休克動物模型檢測3 種經(jīng)高壓結(jié)合胰蛋白酶處理后的“低敏制品”中過敏原的消減效果，結(jié)果見表4。

表4 豚鼠全身過敏反應(yīng)結(jié)果及其評分Table 4 Results and scores of generalized anaphylaxis in guinea pigs

由表4可以看出，陰性對照組豚鼠在靜脈注射后基本沒有任何反應(yīng)，未處理蝦蛋白組（陽性對照）過敏反應(yīng)發(fā)生率及死亡率均為100%，反應(yīng)呈極強陽性。高壓結(jié)合酶法制備的3 種“低敏蝦制品”，過敏原性雖有所降低，但各組過敏反應(yīng)發(fā)生仍為100%，經(jīng)高壓結(jié)合酶法處理的蝦蛋白、蝦肉和蝦仁組豚鼠的死亡率分別為16.7%、50.0%和83.3%。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，該工藝制備的“低敏蝦制品”對于過敏體質(zhì)者接觸后的風險仍極高。

2.2.2 高壓結(jié)合酶法制備的低敏蝦制品引起的Schultz-Dale反應(yīng)

分別用PBS和未處理蝦蛋白進行致敏，再按分組分別用PBS、未處理蝦蛋白、高壓結(jié)合酶法處理獲得的蝦蛋白、蝦肉和蝦仁進行攻擊，結(jié)果見表5。

表5 致敏豚鼠離體腸平滑肌攻擊實驗（n=6，x±s）Table 5 Results of Schultz-Dale reaction on isolated smooth muscle from guinea pigs (n= 6,x s)

表5 致敏豚鼠離體腸平滑肌攻擊實驗（n=6，x±s）Table 5 Results of Schultz-Dale reaction on isolated smooth muscle from guinea pigs (n= 6,x s)

注：***.與1組（陰性對照）比較，差異顯著，P＜0.001；7～10組與6組（陽性對照）比較，差異顯著，▲. P＜0.05，▲▲. P＜0.01，▲▲▲. P＜0.001。

組別 致敏物質(zhì) 攻擊物質(zhì) 致敏途徑 腸平滑肌收縮力/g 收縮力變化率/%攻擊前 攻擊后1 PBS PBS 腹腔注射 0.078±0.029 0.076±0.025 3.0±9.3 2 PBS 未處理蝦蛋白 同1組 0.077±0.020 0.076±0.017 3.6±5.1 3 PBS 處理蝦蛋白 同1組 0.085±0.030 0.087±0.028 3.6±12.1 4 PBS 處理蝦肉蛋白 同1組 0.095±0.040 0.100±0.042 4.9±8.5 5 PBS 處理蝦仁蛋白 同1組 0.088±0.036 0.093±0.036 7.3±11.3 6 未處理蝦蛋白 未處理蝦蛋白 同1組 0.103±0.043 1.422±0.615*** 1 307.0±234.4***7 未處理蝦蛋白 PBS 同1組 0.092±0.046 0.097±0.040▲▲▲ 11.2±5.2▲▲▲8 未處理蝦蛋白 處理蝦蛋白 同1組 0.098±0.049 0.428±0.144***▲▲ 376.9±120.4***▲▲▲9 未處理蝦蛋白 處理蝦肉蛋白 同1組 0.111±0.040 0.889±0.230***▲ 766.2±237.1***▲▲10 未處理蝦蛋白 處理蝦仁蛋白 同1組 0.114±0.037 1.259±0.491*** 1 004.4±112.3***

由表5可以看出，用PBS致敏的各組豚鼠，其致敏腸段給予各觀察物質(zhì)進行攻擊，腸平滑肌的收縮力較攻擊前均變化很小，與陰性對照組（1組）比較，無明顯差異（P＞0.05）。用未經(jīng)處理的蝦蛋白致敏各組豚鼠，采用PBS攻擊，其腸段收縮力變化很小，與1組比較，無統(tǒng)計學意義；與陽性對照組（6組）比較，P＜0.001；與6組比較，經(jīng)未處理蝦蛋白致敏的腸段，分別用經(jīng)高壓結(jié)合酶法處理的蝦蛋白、蝦肉和蝦仁進行攻擊，攻擊后與攻擊前比較，腸平滑肌的收縮力分別增強376.9%、766.2%和1 004.4%。該結(jié)果與全身過敏反應(yīng)的趨勢一致，并具有較明顯的量效關(guān)系。說明經(jīng)高壓結(jié)合酶法處理的蝦蛋白、蝦肉和蝦仁的過敏原性仍很高。

為直觀比較各組腸的反應(yīng)，剪輯各組豚鼠腸收縮曲線，標記后制成圖1（每組取1 例）。

圖1 各組豚鼠腸收縮曲線Fig. 1 Intestinal contraction curves of guinea pigs in each group

由表5和圖1可以看出，用PBS致敏各組（1～5組）給予任何物質(zhì)攻擊，腸平滑肌都比較平穩(wěn)，與1組比較，均為P＞0.05，表明未產(chǎn)生過敏反應(yīng)。未處理蝦蛋白致敏各組（6～10組），用PBS攻擊（7組），腸平滑肌也很平穩(wěn)，而用未處理蝦蛋白（6組，陽性對照）攻擊，腸平滑肌立即發(fā)生極強烈的收縮；用高壓結(jié)合酶法處理的低敏蝦制品分別攻擊，腸平滑肌的收縮也很迅速、強大，表明腸平滑肌處于強致敏狀態(tài)，與1組（陰性對照）比較，均為P＜0.001。此結(jié)果與全身過敏反應(yīng)相一致。

3 討論與結(jié)論

食物過敏，也稱為食物變態(tài)反應(yīng)，是由食物中的某種物質(zhì)或食品添加劑等引起的，其為主要由IgE介導，部分由非IgE（如IgG）介導的超敏反應(yīng)。目前，對食物過敏的研究已成為熱點，但其發(fā)病機制仍不十分清楚，臨床上也沒有有效的治療方法。因此，對過敏體質(zhì)者來講，預(yù)防食物過敏最好的方法是避免食入含過敏原的食物；對食品科學工作者來講，應(yīng)設(shè)法降低食物中的過敏原或開發(fā)脫敏或低敏食品，并建立行之有效的評價體系，使人們食用安全并有營養(yǎng)的物質(zhì)。

有研究顯示，通過加熱等加工方式無法完全消除食物中過敏原，而微量過敏原的攝入就可能引發(fā)嚴重的過敏反應(yīng)[10]。目前，國內(nèi)外學者普遍采用酶解法降低食物中的過敏原，利用酶使蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂，生成小分子肽和氨基酸，而達到降低過敏原的效果[11-12]。超高壓法降解食物中的過敏原也是普遍采用的方法。超高壓能影響生物大分子的結(jié)構(gòu)，改變分子間和分子內(nèi)的非共價作用力，采用這種方法可以通過改變過敏原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而降低其過敏原性，并且可改善食品的營養(yǎng)品質(zhì)[13-14]。將酶解法與超高壓法結(jié)合即為高壓結(jié)合酶法，兩者結(jié)合處理過敏原物質(zhì)，過敏原性會降低更明顯[15]。有報道顯示，在300 MPa高壓下酶解牛β-乳球蛋白AB的效果最好，高壓前、高壓后酶解對水解度沒有顯著影響[16]。本實驗采用高壓與酶解同時處理蝦蛋白、蝦肉和蝦仁。經(jīng)實驗探索，處理3 種蝦產(chǎn)品過敏原的優(yōu)化條件為壓力200 MPa、溫度40 ℃、保壓時間40 min、加酶量2 000～3 000 U/g。經(jīng)體外間接ELISA方法檢測，其中的過敏原分別消減97%、94.1%和94.5%，可認為被檢測的過敏原已大部分消除。

食物過敏檢測的方法主要有體內(nèi)法和體外法。間接ELISA方法是檢測食物過敏原最廣泛、最常用的體外檢測方法[17]。體內(nèi)法中，人體可疑食物激發(fā)實驗[18]具有一定的風險，其結(jié)果的影響因素也很多，在我國極少使用。動物實驗便成為在體檢測食物過敏的重要方法和手段[19]。動物實驗即通過引起食物過敏的動物模型在體檢測食物中過敏原的致敏性，再結(jié)合其他相關(guān)檢測數(shù)據(jù)綜合分析，對過敏原的致敏性做出合理、可靠性更高的評價。

檢測食物過敏的動物模型有多種，常用的動物主要有小鼠[20-23]、大鼠[24-25]、豚鼠[26]、狗[27]、幼豬[28-29]等。豚鼠對過敏原敏感性高，不需要佐劑即可致敏，與人類的過敏原識別機制相似。因此，進行過敏性實驗研究是極佳的備選對象[5,30-31]。本實驗采用腹腔注射致敏，可以避開灌胃（口服）耐受的問題[32]。動物實驗結(jié)果顯示：全身過敏實驗中，模型組（未處理蝦蛋白致敏、未處理蝦蛋白激發(fā)）全部發(fā)生過敏反應(yīng)且死亡，過敏率和死亡率均為100%，過敏反應(yīng)呈極強陽性。經(jīng)高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白、蝦肉、蝦仁組也均出現(xiàn)100%的過敏反應(yīng)，且不同程度地由于過敏性休克而死亡，致敏強弱依次為：蝦仁處理產(chǎn)物＞蝦肉處理產(chǎn)物＞蝦蛋白處理產(chǎn)物。在離體腸實驗中，可見陽性對照組（模型組、未處理蝦蛋白致敏、未處理蝦蛋白攻擊）在受到過敏原攻擊后，腸管收縮極其明顯；各致敏的腸管在經(jīng)高壓結(jié)合酶處理的蝦蛋白、蝦肉、蝦仁攻擊后，收縮也十分明顯，與陰性對照組比較，其收縮改變率均為P＜0.001；與模型組比較，均為P＜0.05。動物離體實驗與在體實驗的結(jié)果一致，表明蝦產(chǎn)品經(jīng)高壓結(jié)合酶處理后，致敏性雖然已明顯減弱，但仍具有極強的致敏性，風險極大，極不安全。

本研究結(jié)果顯示，體內(nèi)體外的檢測結(jié)果出現(xiàn)了不平行的現(xiàn)象，得出了不完全一致的結(jié)論，其可能的原因：體外檢測的是過敏原的某一活性中心，雖然ELISA法靈敏度高、特異性好且操作方便，但其僅能確定抗原與抗體是否發(fā)生了特異性結(jié)合，并不能判定過敏原的致敏性強弱[33]。動物實驗則是觀察綜合性的全身性反應(yīng)，反應(yīng)程度超過了體外檢測結(jié)果，一方面說明過敏原消減還不夠徹底、不夠全面，還應(yīng)做進一步的工藝優(yōu)化，或在此基礎(chǔ)上結(jié)合其他的方法進行過敏原降解。另一方面，由于食物過敏原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體外檢測過敏原要多方法結(jié)合進行綜合分析。因此，在低過敏食品的開發(fā)過程中要注意過敏原的消除是否徹底，不能發(fā)生因過敏原的殘留而導致過敏事件，對食物中過敏原的檢測及其致敏性評價，無論方法靈敏度如何，體外檢測都無法取代動物實驗。