莠去津分子印跡聚合物微球的制備及其吸附性能與在食品檢測中的應(yīng)用

張凱杰，秦思楠，趙春娟，高文惠*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050000）

莠去津是一種廣泛用于玉米、大豆、甘蔗、高粱等農(nóng)田作物的三嗪類除草劑，結(jié)構(gòu)式如圖1所示[1]。由于莠去津農(nóng)藥用量較大、性質(zhì)較穩(wěn)定，在土壤中不易降解，而且在水中有較高溶解度，因此在施用過程中可能對土壤、地表水及飲用水造成污染，從而嚴重威脅人類健康和環(huán)境安全[2-3]。研究表明，莠去津為內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，對人體有潛在致癌、致畸、致突變的作用，同時對動物和水生生物的生殖發(fā)育存在毒害作用[4-5]。

圖1 莠去津結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Chemical structure of atrazine

目前常用于三嗪類農(nóng)藥的檢測方法主要包括高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6-8]、氣相色譜法[9-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[12-14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[15-17]和毛細管色譜法[18-19]等。但通常情況下樣品成分復(fù)雜，而三嗪類除草劑在樣品中含量很低，在樣品前處理過程中盡量減少基質(zhì)效應(yīng)對分析效果的影響是目前學(xué)者需要解決的重要問題。因此，探索一種干擾小、識別性強的分離富集方法具有特別重要的意義。

分子印跡技術(shù)（molecularly imprinted technique，MIT）是一種以目標分子為模板，合成具有特殊分子識別功能的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）的技術(shù)[20]。因MIPs具有高選擇性和特異識別的能力，且制備簡單、成本低、耐苛刻條件、可重復(fù)利用等，已被應(yīng)用于固相萃取[21-24]、手性分離[25]、仿生傳感器[26]、色譜分析等研究領(lǐng)域[27]。

MIPs有多種制備方法，如本體聚合法、沉淀聚合法、懸浮聚合法、表面印跡法等，本體聚合法雖然操作簡單、易控制，但在制備過程中需研磨，可能破壞聚合物內(nèi)部的印跡孔穴，嚴重影響聚合物的選擇性和吸附性，而沉淀聚合法、懸浮聚合法、表面印跡法克服了本體聚合法的缺點。關(guān)于莠去津MIPs的制備已有多篇報道[28-31]，Gkementzoglou等[29]運用微乳液聚合法和沉淀聚合法制備了莠去津納米MIPs微球，結(jié)果顯示由沉淀聚合法制備的MIPs對目標分子表現(xiàn)出更高的吸附容量，并從聚合機理上做出了解釋，沉淀聚合法制備的MIPs可在聚合物的內(nèi)部和表面同時形成結(jié)合位點，而微乳液法僅在表面形成。陳凱尹等[30]以莠去津為模板分子，甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）為功能單體，采用沉淀聚合法制備了粒徑約210 nm的莠去津納米MIPs微球。Liu Guangyang等[31]在甲醇中以Fe3O4-殼聚糖納米粒子為載體，采用表面印跡法制備了一種新型的莠去津磁性MIPs，用于自來水中莠去津的吸附。而如果將MIPs作為固相萃取材料應(yīng)用于樣品前處理，不僅選擇性強，樣品凈化效果好，而且還具有固相萃取材料能反復(fù)使用，能有效防止色譜柱污染等優(yōu)點。

本實驗以莠去津為模板分子，MAA為功能單體，采用沉淀聚合法制備分子印跡聚合微球（molecularly imprinted polymer microspheres，MIPMs），并將其應(yīng)用于食品中三嗪類農(nóng)藥殘留分析，建立食品中莠去津及其結(jié)構(gòu)類似物農(nóng)藥殘留量的分子印跡固相萃取-HPLC檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莠去津（9 6%）；西瑪津（9 8%）；莠滅凈（9 5%）；撲草凈（9 7%）；M A A（分析純）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA，分析純）；偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN，分析純）；甲醇、乙腈（色譜純）；冰乙酸（分析純）；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

L C-2 0 A H P L C儀 日本島津公司；EVOLUTION220型紫外-可見分光光度計 美國Thermo公司；KH5200型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ASE-12型固相萃取儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TGL-15B型高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6320型真空干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外光譜測定

配制1 mmol/L莠去津的乙腈標準溶液、2 mmol/L MAA的乙腈溶液。取5 支10 mL比色管，向各管中加入莠去津標液150 μL，按照模板分子與功能單體物質(zhì)的量比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10向比色管中加入MAA的乙腈溶液150、300、450、600、750 μL。將5 支比色管用乙腈定容至10 mL，超聲10 min，于4 ℃靜置14 h，對上述混合溶液進行紫外光譜掃描。

1.3.2 莠去津MIPMs的制備

取2 個150 mL圓底燒瓶，將0.2 mmol模板分子莠去津（空白不加）和0.8 mmol功能單體MAA放入圓底燒瓶中，用乙腈溶解，室溫超聲30 min，4 ℃預(yù)聚合6 h，形成模板分子-功能單體復(fù)合物，取出至室溫后加入1.5 mL EDMA和35 mg AIBN，超聲混合10 min。然后向圓底燒瓶中通N210 min除去氧氣，在60 ℃恒溫水浴中反應(yīng)24 h；聚合完成后，將聚合混合液于10 000 r/min離心5 min，得白色印跡聚合物（MIPs）和非印跡聚合物（NIPs），用甲醇-乙酸（90∶10，V/V）混合試劑作為洗脫劑去除MIPs中的模板分子，再將MIPs微球于45 ℃，真空度為0.04 MPa條件下干燥6 h，然后放入干燥器中備用，即得到可使用的MIPMs。

1.3.3 結(jié)合量實驗

1.3.3.1 不同聚合物吸附性能的考察

分別向10 mL具塞比色管中加入不同致孔劑量（15、30、50、70 mL）和不同聚合溫度（50、60、70 ℃）制備的莠去津MIPMs及NIPs各20 mg，然后向各比色管中加入1 mmol/L莠去津的乙腈標準溶液5 mL，超聲混勻，25 ℃恒溫振蕩24 h后，10 000 r/min離心5 min，上清液過膜，供HPLC分析。根據(jù)HPLC分析結(jié)果可計算MIPMs和NIPs的吸附容量（式（1））和印跡因子（imprinting factor，IF，式（2））。

式中：Q為聚合物對莠去津的吸附容量/（μmol/g）；C0為莠去津的初始濃度/（μmol/L）；C為莠去津的平衡濃度/（μmol/L）；V為添加的溶液體積/mL；M為稱取聚合物的質(zhì)量/mg。

式中：QMIPMs為MIPMs對莠去津的吸附容量/（μmol/g）；QNIPs為NIPs對莠去津的吸附容量/（μmol/g）。

1.3.3.2 靜態(tài)吸附實驗

稱取20 mg莠去津MIPMs及NIPs分別放入10 mL具塞比色管中，加入一定量莠去津的乙腈標準溶液，濃度范圍在0～600 μmol/L之間，將比色管置于25 ℃恒溫振蕩24 h后，10 000 r/min離心5 min，上清液過膜，供HPLC分析。

1.3.3.3 競爭性吸附實驗

稱取20 mg莠去津MIPMs放入10 mL具塞比色管中，然后加入5 mL一定濃度的西瑪津、莠去津、莠滅凈和撲草凈的乙腈溶液，混合物在25 ℃恒溫振蕩24 h后10 000 r/min離心5 min，上清液過膜，供HPLC分析。

1.3.4 莠去津-MISPE柱的制備

稱取適量MIPMs，放入水中進行超聲分散，然后將勻漿全部裝入具砂芯玻璃層析柱內(nèi)，并裝入固相萃取裝置中待以后實驗備用。柱內(nèi)聚合物的高度2 cm。填裝完成后，在柱頂端塞入脫脂棉，輕壓脫脂棉使其更加緊實。

1.3.5 樣品處理

1.3.5.1 提取

分別稱取磨碎或切碎后樣品5.000 g，果蔬樣品中加入3.000 g無水硫酸鈉，除去過多的水分，谷物中不加，用20 mL乙腈進行提取（分兩次，每次10 mL），攪拌均勻，超聲提取20 min，在4 000 r/min離心10 min，合并上清液，過濾，用乙腈定容至20 mL，待過固相萃取柱。

1.3.5.2 提取液凈化

1）活化：先用10 mL水浸潤柱子，再用10 mL甲醇過柱活化。2）上樣：取樣品提取液1 mL移入固相萃取柱，設(shè)置固相萃取儀壓力為45 kPa。3）淋洗：當(dāng)樣品提取液全部過柱后，用20 mL水淋洗固相萃取柱。4）洗脫：用10 mL甲醇-乙酸（90∶10，V/V）溶液過柱洗脫。收集洗脫液，定容至10 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，供HPLC分析[32]。

1.3.6 HPLC測定條件

色譜柱：Symmetry?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：220 nm；流動相為甲醇-水（86∶14，V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.0和Excel 2007對實驗數(shù)據(jù)進行作圖及統(tǒng)計分析，每組實驗重復(fù)測量3 次，數(shù)據(jù)均為3 次平行實驗平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板物質(zhì)與功能單體最佳比例的選擇

合成MIPs時，功能單體用量直接影響印跡聚合物對模板分子的吸附能力。功能單體加入量少時，模板分子與功能單體在預(yù)聚合過程中形成的復(fù)合物不穩(wěn)定，特異性識別能力不足；當(dāng)功能單體用量過多時，會導(dǎo)致聚合物的非特異性吸附能力增強，致使特異性識別能力變差[33]。

固定莠去津的濃度，逐漸增加MAA的濃度，用紫外分光光度計測得混合液的吸收曲線，如圖2a所示。當(dāng)莠去津與MAA的比例由1∶2變化到1∶10時，混合液的最大吸收波長從205 nm增加到212 nm（圖2b）。當(dāng)混合物體系最大吸收波長對應(yīng)的吸光度變化趨于平緩時，說明混合物物質(zhì)的量比例對模板分子與功能單體之間的作用趨于穩(wěn)定，此時平緩區(qū)的轉(zhuǎn)折點所對應(yīng)的混合物比例是最佳配比[34]。由圖2b可知，莠去津與MAA物質(zhì)的量比在1∶4～1∶10范圍之間混合物的吸光度隨波長紅移量的變化趨于平緩，由此推斷，莠去津與功能單體MAA的最佳物質(zhì)的量比為1∶4。

圖2 莠去津和MAA比例對預(yù)組裝體系紫外光譜的影響Fig. 2 Effect of different ratios of MAA to atrazine on UV spectrum of pre-assembled systems

2.2 致孔劑用量和聚合溫度對聚合物吸附性能的影響

在莠去津、MAA和EDMA加入量分別為0.2 mmol、0.8 mmol和1.5 mL的條件下，改變乙腈的加入量和聚合溫度，考察這些條件制備的聚合物對莠去津吸附性能的影響。通過平衡結(jié)合實驗，比較各MIPMs和NIPs的吸附容量Q和IF，其中IF是評價印跡成功與否的最直觀指標，結(jié)果見表1。

表1 不同聚合條件對聚合物吸附性能的影響Table 1 Effect of different polymerization conditions on adsorption properties of polymers

從表1可見，乙腈50 mL、聚合溫度60 ℃時吸附量大而且印跡效果好。MIPMs1～MIPMs3的比較發(fā)現(xiàn)，增加致孔劑的用量可以提高聚合物吸附量和選擇性；由圖3可以看出，當(dāng)乙腈用量為15 mL或30 mL時，聚合物不能形成均勻的顆粒，團聚情況比較嚴重，這可能是因為當(dāng)致孔劑用量較少時，聚合反應(yīng)接近于本體聚合；當(dāng)乙腈用量為50 mL或70 mL時，沉淀聚合形成聚合微球，且粒徑均勻，無團聚現(xiàn)象，其粒徑大小分別為120 nm和200 nm左右。乙腈用量為50 mL時，聚合物微球粒徑小、比表面積大，吸附量大；但當(dāng)乙腈用量達到70 mL時，由于自由基單體濃度降低導(dǎo)致聚合反應(yīng)速率減慢，形成的聚合物較少，宏觀表現(xiàn)為材料結(jié)構(gòu)松散、易碎。因此本實驗選擇乙腈用量為50 mL，該條件下制備的聚合物微球粒度較文獻[30]小很多，且分散性好。對MIPMs3、MIPMs5、MIPMs6進行比較，研究聚合溫度對聚合物微球性能的影響。結(jié)果表明，聚合溫度越高，聚合速率越快，當(dāng)聚合溫度達到70 ℃時，出現(xiàn)爆聚現(xiàn)象，即短時間內(nèi)合成大量的MIPMs，由表1可以看出，爆聚現(xiàn)象影響了MIPMs識別位點的形成，導(dǎo)致MIPMs的吸附性能下降；聚合溫度為60 ℃時，12 h左右出現(xiàn)大量MIPMs；50 ℃時，常常出現(xiàn)無聚合現(xiàn)象，這可能是由于引發(fā)劑AIBN需要一定的溫度才能進行熱引發(fā)，若溫度過低，無法達到引發(fā)劑的熱分解溫度，聚合將不能進行。綜上，選用60 ℃作為最佳聚合溫度。

圖3 不同乙腈用量聚合物微球的掃描電鏡圖Fig. 3 Scanning electron micrographs of polymer microspheres with different amounts of different acetonitrile

2.3 聚合物吸附性能

2.3.1 靜態(tài)平衡結(jié)合實驗及Scatchard分析

一般通過靜態(tài)平衡吸附法評價MIPs對目標分子的選擇性能。由圖4可以看出，MIPMs比NIPs對模板分子有更好的吸附性，在莠去津濃度大于300 μmol/L時，在相同濃度下，MIPMs吸附量遠大于NIPs吸附量。這說明，MIPMs在制備過程中，形成了與模板分子互補的三維空穴結(jié)構(gòu)，它對模板分子有記憶功能，具有特異選擇性。但是合成NIPs時由于未加入模板物質(zhì)，因此NIPs對模板分子無特異選擇性。

圖4 MIPMs和NIPs對莠去津的靜態(tài)吸附等溫線Fig. 4 Static adsorption isotherms of MIPMs and NIPs toward atrazine

圖5 MIPMs吸附性的Scatchard曲線Fig. 5 Scatchard curve of MIPMs adsorption

由Scatchard分析可以獲得聚合物對目標分子吸附位點的種類、解離常數(shù)及最大吸附量等信息。Scatchard方程見式（3）：

式中：Q為聚合物對莠去津的吸附量/（μmol/g）；C為莠去津的平衡濃度/（μmol/L）；Qmax為吸附位點的最大表觀結(jié)合量/（μmol/g）；Kd為吸附位點的解離平衡常數(shù)/（μmol/L）。

由圖5可知，Q/C對Q是非線性的，說明MIPMs對莠去津的吸附是非均一的，原因可能是聚合過程中加熱容易造成體系中熱力學(xué)條件的不均勻，使模板分子和功能單體產(chǎn)生不同的作用形式，同時自由基聚合過程的不穩(wěn)定性致使空穴的大小產(chǎn)生差異，影響了結(jié)合動力學(xué)特性的均一性[35]。從圖5可以看出，Scatchard分析圖中有兩個線性較好的部分，說明MIPMs對模板分子主要存在兩類吸附位點。對兩個線性部分進行擬合，得到兩個線性方程：第1類吸附位點的方程為y=2.486-0.042 7x，其解離常數(shù)Kd1為23.42 μmol/L，最大表觀結(jié)合量Qmax1為58.22 μmol/g；第2類吸附位點的方程為y=0.735-0.002 6x，解離常數(shù)Kd2為384.62 μmol/L，最大表觀結(jié)合量Qmax2為282.69 μmol/g。

2.3.2 競爭性吸附性能

為考察MIPs的特異性吸附能力，用莠去津MIPMs對莠去津及其結(jié)構(gòu)類似物西瑪津、莠滅凈、撲草凈的吸附性能進行測試。

圖6 MIPMs對莠去津及其結(jié)構(gòu)類似物的吸附選擇性Fig. 6 Adsorption selectivity of MIPMs toward atrazine and its structural analogues

由圖6可知，MIPMs對4 種三嗪類除草劑均有吸附，吸附效果依次為莠去津＞西瑪津＞莠滅凈＞撲草凈，說明多種物質(zhì)存在時MIPMs對其吸附性能存在差異，主要原因是4 種農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量的大小不同。首先是MIPMs對模板物質(zhì)莠去津的吸附性能最好，其次是分子質(zhì)量最小的西瑪津，而分子質(zhì)量大于模板物質(zhì)的莠滅凈與撲草凈吸附量較小。

2.4 分子印跡固相萃取柱的重復(fù)性和穩(wěn)定性

為驗證分子印跡固相萃取柱的重復(fù)性和穩(wěn)定性，實驗取濃度為1 mmol/L莠去津標液1 mL按1.3.5.2節(jié)方法過分子印跡固相萃取柱。由表2可以看出，使用分子印跡固相萃取柱10、30、50、70、90、100 次，莠去津過MISPE洗脫液峰面積沒有發(fā)生明顯變化，即固相萃取柱并未隨著使用次數(shù)的增加其吸附效果有所降低，說明分子印跡固相萃取柱具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表2 固相萃取柱可反復(fù)使用次數(shù)Table 2 Reusability of MISPE column

2.5 色譜條件的選擇

2.5.1 檢測波長的選擇

圖7 4 種三嗪類農(nóng)藥的紫外光譜圖Fig. 7 UV absorption spectra of four triazine herbicides

由圖7可知，西瑪津、莠滅凈、莠去津和撲草凈的最大吸收波長分別為212、218、222、222 nm，綜合考慮各物質(zhì)的紫外吸收情況，檢測波長以220 nm為宜。

2.5.2 流動相比例選擇

本實驗分別考察不同比例的甲醇-水（90∶10、86∶14、83∶17、80∶20，V/V）對4 種三嗪類農(nóng)藥保留行為的影響。流動相中當(dāng)甲醇比例較高時（如90%甲醇），4 種三嗪類農(nóng)藥出峰快；水體積相對較少時，如80∶20，則4 種三嗪類農(nóng)藥保留時間偏長；當(dāng)甲醇-水（86∶14，V/V）時，4 種三嗪類農(nóng)藥保留時間適宜，且分離效果好，如圖8所示。因此，本實驗選擇甲醇-水（86∶14，V/V）作為流動相。

圖8 4 種三嗪類農(nóng)藥分離過程中流動相比例的選擇Fig. 8 Selection of mobile phase composition for separation of four triazine herbicides

2.6 莠去津-MISPE-HPLC檢測食品中三嗪類農(nóng)藥殘留

2.6.1 線性關(guān)系與檢出限

分別配制4 種三嗪類農(nóng)藥質(zhì)量濃度為0.5～50 μg/mL的一系列標準溶液，在1.3.6節(jié)色譜條件下對配制的溶液進行測定。以待測物質(zhì)量為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，得到線性關(guān)系曲線，結(jié)果如表3所示。

表3 4 種三嗪類農(nóng)藥線性關(guān)系及檢出限Table 3 Linear relationship and detection limits for four triazine herbicides

2.6.2 莠去津固相萃取柱對樣品的凈化和吸附能力

為考察莠去津固相萃取柱對樣品中4 種三嗪類農(nóng)藥的凈化吸附能力，實驗選擇多種樣品進行測定，按照1.3.1節(jié)對樣品進行提取，樣品提取液和樣品加標提取液用分子印跡固相萃取柱進行處理，然后用HPLC儀檢測。由圖9和圖10a、b可知，在樣品中未檢出目標物。

圖9 小麥樣品提取液（a）、過MISPE洗脫液（b）和樣品加標提取液過MISPE洗脫液（c）色譜圖Fig. 9 Chromatograms of wheat extract (a), eluate from MISPE (b)and spiked eluate from MISPE (c)

圖10 蘋果樣品提取液（a）、過MISPE洗脫液（b）和樣品加標提取液過MISPE洗脫液（c）色譜圖Fig. 10 Chromatograms of apple extract (a), eluate from MISPE (b)and spiked eluate from MISPE (c)

同時，從圖9、10還可以看出，該固相萃取柱可以從復(fù)雜基質(zhì)中特異性分離富集目標物，對樣品凈化效果好（比較圖9和圖10a、b），該萃取柱只對目標物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)類似物有選擇性，而對雜質(zhì)不具有吸附能力（比較圖9和圖10a、c）。

2.6.3 樣品回收率和精密度實驗

表4 回收率和精密度實驗結(jié)果（n=5）Table 4 Recovery and precision of the method (n= 5)

為考察莠去津-MISPE-HPLC方法準確性和重復(fù)性，本實驗選取玉米、小麥、甘蔗和蘋果樣品，分別在0.1 μg/mL和5 μg/mL加標量條件下進行回收率實驗，結(jié)果見表4。樣品中4 種三嗪類農(nóng)藥的加標平均回收率在86.2%～95.7%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.98%～4.51%（n=5），說明本方法回收率高、精密度好，基本滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

3 結(jié) 論

采用沉淀聚合法合成了莠去津MIPs微球，并優(yōu)化了聚合工藝。當(dāng)莠去津和MAA物質(zhì)的量比1∶4、致孔劑乙腈用量50 mL、聚合溫度60 ℃時，制備的莠去津MIPMs吸附效果最好。靜態(tài)吸附結(jié)果表明，所制得的MIPMs對模板物質(zhì)具有較強的吸附能力；由Scatchard分析可知，莠去津和功能單體MAA形成了兩類結(jié)合位點。競爭性吸附實驗結(jié)果表明MIPMs不僅對模板物質(zhì)莠去津有很好的吸附能力，對其他3 種結(jié)構(gòu)類似物西瑪津、莠滅凈和撲草凈均有吸附，吸附能力依次為莠去津＞西瑪津＞莠滅凈＞撲草凈。將莠去津MIPMs作為固相萃取填料制備了MISPE柱，建立了莠去津-MISPEHPLC檢測食品中4 種三嗪類農(nóng)藥殘留的方法。結(jié)果表明，莠去津MISPE柱對三嗪類農(nóng)藥殘留有很好的吸附富集能力和樣品凈化效果，樣品加標平均回收率為86.2%～95.7%， RSD不高于4.51%（n=5），檢出限為0.5～5 ng/mL，基本滿足農(nóng)藥殘留分析要求。