基于可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌

郭建平，萬佳佳，陸兆新，呂鳳霞，張 充，趙海珍，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種主要的食源性致病菌[1]，可產(chǎn)生多種腸毒素，引起食物中毒。消毒雖然可以殺滅金黃色葡萄球菌，卻并不能完全破壞其分泌的毒素。金黃色葡萄球菌易污染肉、奶及其制品等食品[2-3]，人們?nèi)绻`食這些污染過的食品，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等食物中毒反應(yīng)，嚴(yán)重者可能會(huì)導(dǎo)致死亡。金黃色葡萄球菌引起的食品安全事件[4-6]時(shí)有發(fā)生，給人們的生命安全帶來嚴(yán)重的威脅，對(duì)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損害，因此做好致病菌的檢測(cè)顯得尤為重要。

GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中規(guī)定的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法[7]周期較長(zhǎng)，不利于食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)，且較長(zhǎng)的檢測(cè)周期會(huì)對(duì)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)活動(dòng)造成一定的影響。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展[8]使得金黃色葡萄球菌的檢測(cè)周期大大縮短，但是PCR檢測(cè)需要昂貴的儀器，所以PCR技術(shù)在條件和技術(shù)相對(duì)落后的地區(qū)，仍不能滿足基層對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)的需求。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是由日本科學(xué)家Notomi等[9]率先建立的新型體外擴(kuò)增DNA技術(shù)，得益于它特殊的擴(kuò)增原理，使其具備耗時(shí)短、高特異性、高靈敏度、不依賴精密儀器、便捷準(zhǔn)確等顯著優(yōu)勢(shì)。LAMP反應(yīng)結(jié)果主要是通過凝膠電泳法、沉淀法、顯色法等方法進(jìn)行檢測(cè)[10]。Tomita等[11]通過將鈣黃綠素加入到LAMP反應(yīng)體系中，建立了一種可以不開蓋檢測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果的技術(shù)。Goto等[12]建立了另外一種可視化LAMP檢測(cè)方法，通過向LAMP反應(yīng)體系中添加羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue，HNB）達(dá)到可視化檢測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果，且添加HNB的LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)靈敏度較添加鈣黃綠素的LAMP反應(yīng)體系高出10 倍，主要是由于鈣黃綠素對(duì)LAMP反應(yīng)有一定的抑制作用，而HNB對(duì)LAMP反應(yīng)沒有抑制作用。

現(xiàn)常用來檢測(cè)金黃色葡萄球菌的目的基因?yàn)槟蜔岷怂崦富?，即nuc基因[13]，但有研究發(fā)現(xiàn)其他少數(shù)葡萄球菌也具有耐熱核酸酶基因[14]，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。本研究中利用實(shí)驗(yàn)室篩選出的金黃色葡萄球菌特異性靶點(diǎn)基因SAR0395[15]建立一種可視化LAMP檢測(cè)方法，該可視化LAMP不需要昂貴的設(shè)備且操作簡(jiǎn)單，可以在設(shè)備較落后的地區(qū)進(jìn)行金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)，同時(shí)該可視化LAMP可以結(jié)合酶標(biāo)儀進(jìn)行金黃色葡萄球菌的高通量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本研究所涉及到菌株包括46 株金黃色葡萄球菌和24 株非金黃色葡萄球菌。其中標(biāo)準(zhǔn)菌株分別購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）、廣東省微生物菌種保藏中心（GIMCC）、美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心（CMCC）（表1），其他菌株為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Bst2.0 WarmStart? DNA聚合酶、MgSO4NEB（北京）有限公司；甜菜堿 上海源葉生物科技有限公司；HNB上海麥克林生化科技有限公司；基因組提取試劑盒美國(guó)OMEGA Bio-Tek公司；100 bp Marker 廣州東盛生物科技有限公司；dNTP Mixture 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T1300II級(jí)生物安全柜 賽默飛世爾科技公司；PTC-100TMPCR擴(kuò)增儀 美國(guó)MJ Research公司；A10干式恒溫器 杭州龍揚(yáng)科學(xué)儀器有限公司；PowerPac?HC高電流電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；JS-380c全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；Nanodrop2000核酸濃度測(cè)定儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

以實(shí)驗(yàn)室篩選的金黃色葡萄球菌高特異性序列SAR0395為靶基因[15]，通過在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V5（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）設(shè)計(jì)LAMP引物，引物序列見表2，引物由金斯瑞生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成。

表2 LAMP反應(yīng)引物Table 2 LAMP reaction primers

1.3.2 基因組提取方法

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌基因組提取方法：使用商品化的OMEGA基因組提取試劑盒并按其說明提取制備模板DNA。

革蘭氏陰性細(xì)菌基因組提取方法：取2 mL菌液放入1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，保留沉淀；加入無菌水1 mL吹打混勻，12 000 r/min離心2 min，棄上清液；然后加TE緩沖液（pH 8.0）100 μL混勻，置100 ℃煮沸10 min，冰上冷卻10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液為DNA模板，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 初始LAMP反應(yīng)方法

參照一般LAMP反應(yīng)體系[16]，本研究原始LAMP反應(yīng)體系如下：外側(cè)引物（F3和B3）各0.2 μmol/L，內(nèi)側(cè)引物（FIP和BIP）各1.6 μmol/L，dNTPs終濃度1.5 mmol/L，Mg2＋終濃度6.0 mmol/L，1×ThermoPol buffer（20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% TritonX-20，pH 8.8，25 ℃），Bst2.0 WarmStart? DNA聚合酶終濃度0.32 U/μL，1 μL DNA模板，加水補(bǔ)足20 μL。20 μL滅菌石蠟油進(jìn)行液封。

反應(yīng)條件：60 ℃，保溫1 h。檢測(cè)方法：取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物和上樣緩沖液混合后，2%凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4 LAMP反應(yīng)的建立及優(yōu)化

以金黃色葡萄球菌GIM1.771的基因組為模板進(jìn)行LAMP體系的優(yōu)化。分別設(shè)置不同溫度、Mg2＋濃度、內(nèi)引物濃度、酶添加量、dNTPs濃度、甜菜堿濃度[17]進(jìn)行LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)果通過2%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，選擇最佳的反應(yīng)體系。

1.3.5 LAMP反應(yīng)可視化方法的建立

HNB是一種Mg2＋指示劑，可以添加到LAMP體系中作為顯色劑，LAMP反應(yīng)前后顏色由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色。按照文獻(xiàn)中的LAMP添加體系[18]，本研究中向優(yōu)化的LAMP體系中添加120 μmol/L HNB。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性組，觀察顏色變化，同時(shí)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.6 不同引物添加體系的分析

不同引物添加體系對(duì)LAMP分析速度有很明顯的影響，本研究中設(shè)置I（B3＋FIP＋BIP）、II（B3＋F3＋FIP＋BIP）、III（B3＋FIP＋BIP＋LF）、IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）、V（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LF）、VI（B3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）6 個(gè)不同引物添加體系[19]，分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)20、30、40、50、60 min，LAMP反應(yīng)結(jié)果通過觀察顏色變化判定。通過實(shí)驗(yàn)選擇出反應(yīng)時(shí)間較短的LAMP引物添加體系。

1.3.7 可視化LAMP的靈敏度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用兩種方法從不同方面對(duì)可視化LAMP的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括基因組梯度稀釋法和菌落梯度稀釋法。

1.3.7.1 基因組靈敏度測(cè)定

測(cè)定得到金黃色葡萄球菌基因組質(zhì)量濃度為103 ng/μL，按照10 倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，取不同質(zhì)量濃度基因組進(jìn)行可視化LAMP檢測(cè)，反應(yīng)時(shí)間分別為30 min和60 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過觀察顏色變化判斷。

1.3.7.2 菌落靈敏度測(cè)定

將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌GIM1.771用生理鹽水進(jìn)行10 倍系列稀釋。用稀釋平板法，測(cè)定純培養(yǎng)物活菌數(shù)；同時(shí)從每稀釋濃度菌液中取1 mL菌液提取基因組，取不同菌落梯度的基因組進(jìn)行可視化LAMP檢測(cè)，LAMP反應(yīng)時(shí)間為30 min和60 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過觀察顏色變化判斷。

1.3.8 可視化LAMP的特異性測(cè)定

將46 株金黃色葡萄球菌和24 株非金黃色葡萄球菌接種到新鮮培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)提取基因組，取提取的基因組進(jìn)行可視化LAMP檢測(cè)，LAMP反應(yīng)時(shí)間為60 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過觀察顏色變化判斷。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)的建立與優(yōu)化

圖1 LAMP體系的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of LAMP reaction conditions

根據(jù)初始LAMP體系建立金黃色葡萄球菌的LAMP檢測(cè)方法，對(duì)溫度、Mg2＋濃度、內(nèi)引物濃度、酶添加量、dNTPs濃度、甜菜堿濃度進(jìn)行優(yōu)化。從圖1A可以發(fā)現(xiàn)，60、61、62 ℃條件下的梯形條帶較其他溫度亮，且60、61、62 ℃條件下的梯形條帶亮度沒有顯著性差異，考慮到簡(jiǎn)易加熱裝置的加熱時(shí)間，選擇LAMP反應(yīng)溫度為60 ℃。從圖1B可以看出，dNTPs濃度為1、1.5、2、2.5 mmol/L時(shí)，LAMP反應(yīng)結(jié)果優(yōu)于dNTPs濃度為0.5 mmol/L時(shí)的LAMP反應(yīng)結(jié)果，且它們之間沒有顯著差異，因此選擇LAMP反應(yīng)的dNTPs濃度為1 mmol/L。從圖1C可以看出，酶添加量為0.4 U/μL和0.48 U/μL時(shí)，LAMP反應(yīng)結(jié)果較好且它們之間無顯著差異，同時(shí)從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，選擇LAMP反應(yīng)的酶含量為0.4 U/μL。從圖1D可以看出，Mg2＋含量過低或過高都會(huì)影響LAMP反應(yīng)，Mg2＋濃度為1、2、3、4 mmol/L時(shí)，LAMP反應(yīng)結(jié)果無顯著差異，綜合考慮，選擇LAMP反應(yīng)的Mg2＋濃度4 mmol/L。從圖1E可以看出，不同內(nèi)外引物比對(duì)LAMP反應(yīng)結(jié)果的影響不顯著，綜合考慮選擇LAMP反應(yīng)的內(nèi)外引物比為8∶1。從圖1F可以看出，甜菜堿濃度為0 mol/L時(shí)，凝膠電泳中條帶最亮，添加不同含量甜菜堿以后，電泳條帶反而變暗，這一結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的甜菜堿可以提高LAMP反應(yīng)效率的結(jié)果相反，在本研究中添加甜菜堿反而不利于LAMP反應(yīng)的進(jìn)行，因此在本研究中不添加甜菜堿。

通過LAMP反應(yīng)的優(yōu)化，可以得到最優(yōu)的LAMP添加體系為：外側(cè)引物（F3和B3）各0.2 μmol/L，內(nèi)側(cè)引物（FIP和BIP）各1.6 μmol/L，dNTPs終濃度1 mmol/L，Mg2＋終濃度4.0 mmol/L，1×ThermoPol buffer（20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% TritonX-20，pH 8.8，25 ℃），Bst2.0 WarmStart? DNA聚合酶終濃度0.4 U/μL，1 μL DNA模板，加水補(bǔ)足20 μL。20 μL滅菌石蠟油進(jìn)行液封。反應(yīng)條件：60 ℃、保溫1 h。

2.2 可視化LAMP檢測(cè)方法的建立

圖2 可視化LAMP顯色結(jié)果（A）及其凝膠電泳圖（B）Fig. 2 Visual color of blank control and positive LAMP reaction (A)and corresponding gel electropherograms (B)

在優(yōu)化過的LAMP反應(yīng)體系中添加120 μmol/L的HNB，60 ℃反應(yīng)1 h，可以觀察到LAMP顯色圖（圖2A）的顏色變化，陽(yáng)性反應(yīng)管中的液體由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，空白對(duì)照反應(yīng)管中的液體保持為紫色；取空白對(duì)照反應(yīng)液和陽(yáng)性反應(yīng)液進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，可以得到電泳圖（圖2B），陽(yáng)性反應(yīng)管出現(xiàn)典型的LAMP梯形條帶，空白對(duì)照沒有出現(xiàn)電泳條帶；實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在LAMP反應(yīng)體系中添加120 μmol/L的HNB，可以建立一種可視化LAMP；可視化LAMP在60 ℃反應(yīng)1 h，空白對(duì)照的顏色和陽(yáng)性反應(yīng)的顏色可以用肉眼清楚辨別。

2.3 不同引物添加體系分析

表3 不同引物組合優(yōu)化Table 3 Optimization of different primer combinations

通過對(duì)不同引物添加體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從表3發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)20 min后，引物添加體系IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）會(huì)發(fā)生顏色變化，反應(yīng)管變?yōu)樘焖{(lán)色；V（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LF）、VI（B3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）的顏色會(huì)在LAMP反應(yīng)30 min后變?yōu)樘焖{(lán)色；I（B3＋FIP＋BIP）、III（B3＋FIP＋BIP＋LF）的顏色會(huì)在LAMP反應(yīng)40 min后變?yōu)樘焖{(lán)色；II（B3＋F3＋FIP＋BIP）的顏色會(huì)在LAMP反應(yīng)60 min后變?yōu)樘焖{(lán)色，空白對(duì)照顏色一直為紫色。實(shí)驗(yàn)中引物添加體系IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）會(huì)在反應(yīng)20 min后，發(fā)生顏色的變化，是最優(yōu)的引物添加體系，本研究中選擇LAMP反應(yīng)的引物添加體系為IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF），這一引物添加體系和文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致。

2.4 可視化LAMP的靈敏度

表4 可視化LAMP靈敏度測(cè)定結(jié)果Table 4 Sensitivity of LAMP

通過平板計(jì)數(shù)得到原始菌液的菌落數(shù)為1.9×109CFU/mL。如表4所示，可視化LAMP反應(yīng)30 min以后，其基因組靈敏度可以達(dá)到1.03 pg/μL，其菌落靈敏度可以達(dá)到1.9×104CFU/mL。這一靈敏度和文獻(xiàn)中報(bào)道的靈敏度有一定差距，所以按照文獻(xiàn)[21]，將LAMP反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為60 min。可視化LAMP反應(yīng)60 min以后，其基因組靈敏度可以達(dá)到0.010 3 fg/μL，其菌落靈敏度可以達(dá)到1.9 CFU/mL。

2.5 可視化LAMP的特異性

圖3 可視化LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Specificity of LAMP

如圖3所示，可視化LAMP反應(yīng)60 min以后，可以發(fā)現(xiàn)46 株金黃色葡萄球菌的反應(yīng)液顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，LAMP反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性；24 株非金黃色葡萄球菌反應(yīng)液顏色未變化仍然為紫色，LAMP反應(yīng)結(jié)果為陰性；通過特異性實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)該可視化LAMP檢測(cè)方法具有良好的特異性。

3 討 論

本研究建立了一種針對(duì)金黃色葡萄球菌的快速、高靈敏度、高特異性的可視化LAMP檢測(cè)方法。目前金黃色葡萄球菌分子檢測(cè)常用目的基因?yàn)槟蜔岷怂崦富颍╪uc）[22-24]，但現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)其他少數(shù)葡萄球菌也具有耐熱核酸酶基因[14]，可產(chǎn)生耐熱核酸酶，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。同樣地，LAMP檢測(cè)技術(shù)的研究有很多，但較低的特異性和易交叉污染的特點(diǎn)限制了LAMP的實(shí)際應(yīng)用。為解決以上問題，本研究以金黃色葡萄球菌新型特異性靶基因SAR0395為目標(biāo)片段，建立了一種特異性高、結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏高的可視化LAMP反應(yīng)體系。

本研究使用的D N A擴(kuò)增酶為N E B公司Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，實(shí)驗(yàn)證明使用該酶時(shí)，反應(yīng)體系建立以后立即進(jìn)行LAMP反應(yīng)與25 ℃孵育2 h以后進(jìn)行LAMP反應(yīng)獲得的反應(yīng)結(jié)果是一致[25]。因此，使用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶可以避免在室溫條件下建立反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增。

研究表明，LAMP反應(yīng)開蓋進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，易造成LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氣溶膠擴(kuò)散到環(huán)境空氣中，污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，造成LAMP反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性[9,11,26]。這一特點(diǎn)大大影響了LAMP反應(yīng)的應(yīng)用，本研究添加20 μL石蠟油于反應(yīng)液上，可以提高反應(yīng)體系的密封性，防止樣品之間的交叉污染，避免反應(yīng)結(jié)果的假陽(yáng)性。在LAMP反應(yīng)體系中添加HNB，建立可肉眼辨別反應(yīng)結(jié)果的可視化LAMP，可以實(shí)現(xiàn)不開蓋進(jìn)行LAMP結(jié)果的觀察，避免開蓋檢測(cè)導(dǎo)致的氣溶膠，可以達(dá)到避免假陽(yáng)性的作用。

張濤濤等[27]建立了一種金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)方法，其靈敏度可以達(dá)到100 fg/μL；宋濤平等[28]建立了一種金黃色葡萄球菌LAMP可視化快速檢測(cè)方法，其靈敏度可以達(dá)到0.001 ng/μL；李曉霞等[29]建立了一種原料乳中金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)方法，其靈敏度可以達(dá)到67 CFU/mL。本研究中建立的可視化LAMP具有更優(yōu)的靈敏度，其基因組靈敏度可以達(dá)到0.010 3 fg/μL，其菌落靈敏度可以達(dá)到1.9 CFU/mL。利用該可視化LAMP對(duì)46 株金黃色葡萄球菌和24 株非金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，24 株非金黃色葡萄球菌都未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，證實(shí)該可視化LAMP具有很好的特異性和可靠性。

本研究建立一種針對(duì)金黃色葡萄球菌的可視化LAMP檢測(cè)方法，并驗(yàn)證了其特異性與靈敏度。通過添加HNB、石蠟油和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶等手段可以有效控制假陽(yáng)性。本研究中建立的可視化LAMP具有快速、直觀、高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，該可視化LAMP將會(huì)成為食品中金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)的重要手段，為金黃色葡萄球菌的檢測(cè)與控制做出重要貢獻(xiàn)。