血當(dāng)歸總黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

楊靜　羅廷順　肖培云　楊懷鏡　藍(lán)海　楊永壽

【摘 要】 目的：研究血當(dāng)歸總黃酮提取工藝及其體外抗氧化活性。方法：采用超聲法提取血當(dāng)歸總黃酮，在510nm處測(cè)定總黃酮的含量，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和 L9 （3.3）正交設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。并以抗壞血酸為陽性對(duì)照，探討了其對(duì)1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（ DPPH· ），2， 2-聯(lián)氮-二（ 3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸 ） 二銨鹽自由基（ ABTS.+· ）及羥自由基（·OH ）的清除能力。結(jié)果：血當(dāng)歸總黃酮提取的最佳條件為料液比1∶30 g·mL.-1，乙醇濃度65 %，提取時(shí)間45 min，提取血當(dāng)歸總黃酮的含量可達(dá)90.05mg·g.-1。此條件下得到的血當(dāng)歸總黃酮提取物清除DPPH·，ABTS.+·和·OH的能力良好，尤其對(duì)ABTS.+·清除能力最優(yōu)，其IC50值分別為 11.62、1.83、136.12mg·L..-1。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、合理，血當(dāng)歸總黃酮有較好的體外抗氧化活性并呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 血當(dāng)歸;總黃酮;提取工藝;抗氧化活性

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）15-0045-05

血當(dāng)歸又名化血丹、花葉天、花蝴蝶、黃澤蘭、赤脛散、散血蓮、草見血等，是蓼科蓼屬植物赤脛散（Polygonum runcinatumBuch.-Ham.ex D.Don var. sinense Hemsl.）的根，主要分布于云南、貴州、四川等省[1]。白族民間應(yīng)用非常廣泛，具有清熱解毒、補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、舒經(jīng)活絡(luò)的功效，大理民間白醫(yī)用于治療婦女月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、干血癆及其心血管疾病等[2]。

作為藥物在月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、乳腺炎、癰癤腫毒等癥狀時(shí)充分發(fā)揮其活血舒筋、消腫止血之功效[3-4]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道蓼屬植物主要含有黃酮、鞣質(zhì)、蒽醌、萜類等多種化學(xué)成分[5-7]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，血當(dāng)歸的乙醇提取物的水溶液對(duì)志賀氏痢疾桿菌有明顯的抑制作用[8-9]，醇提液對(duì)豬油有較強(qiáng)的抗氧化能力[10]。目前未見報(bào)道關(guān)于血當(dāng)歸總黃酮提取工藝及其體外抗氧化活性的研究。研究采用超聲法提取血當(dāng)歸總黃酮，且以總黃酮的含量為指標(biāo)，采用L9 （3.3） 正交表進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳提取工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，同時(shí)以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，對(duì)血當(dāng)歸總黃酮的體外抗氧化性進(jìn)行研究，為血當(dāng)歸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），XSE205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司），WVC-D22H型數(shù)顯超聲波清洗器（DAI HAN Scientific Ultrasonic Cleaner）。

1.2 材料 實(shí)驗(yàn)所用血當(dāng)歸樣品于2018年11月采自云南省大理州巍山縣廟街鎮(zhèn)，經(jīng)大理州食品藥品檢驗(yàn)所楊懷鏡主任藥師鑒定為蓼科蓼屬植物血當(dāng)歸（Polygonum runcinatumBuch.-Ham.ex D.Don var. sinense Hemsl.）。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：SA4BJ-QR，純度98.2%，東京化成工業(yè)），DPPH（批號(hào)：FBYXL-DR，純度>97.0%，東京化工），ABTS（批號(hào)：YS8111502，純度>98%，上海思域化工），抗壞血酸（批號(hào)：20160317，純度≥99.7%，廣東光華科技），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對(duì)照品與供試品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加濃度為65%的乙醇溶液適量，超聲使蘆丁溶解完全，再用65%乙醇定容，搖勻，避光保存，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取樣品（過60目篩）約1.0 g，置具塞三角瓶中，加入0.1 g氫氧化鈣，混勻，再加入65%乙醇溶液25 mL，超聲提取45 min，抽濾，濾液用65%乙醇溶液定容至100 mL，避光保存。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL分別置于25mL量瓶中，再加5%NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液1mL，搖勻，放置6min，再加入4%NaOH溶液10mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15min，同法做空白，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[11]。以吸光度值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)蘆丁含量（mg·mL.-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為 Y=13.06X-0.0125，r= 0.9995。結(jié)果表明：蘆丁在0.008～0.054mg·mL.-1范圍內(nèi)具線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液3.0mL，按“2.2.1”項(xiàng)下連續(xù)測(cè)定6次吸光度，RSD值為0.30%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取6份樣品，每份約1.0g，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定吸光度?？傸S酮含量的RSD值為0.91%。表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1.0mL，按“2.2.1”項(xiàng)下，分別在0、5、10、20、30、45、60min測(cè)定吸光度，RSD值為0.15%，表明在60 min內(nèi)，供試品溶液有良好的穩(wěn)定性。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量（90.05mg·g.-1）的樣品9份，每份0.5g，按表1加入蘆丁對(duì)照品。按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，取供試品溶液1.0mL，置25mL量瓶中，其余操作同“2.2.1”，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.3 含量測(cè)定 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算血當(dāng)歸總黃酮含量。

式中： C為樣品的濃度（mg·mL.-1） ，V為提取液定容體積（mL） ，D為測(cè)定時(shí)定容的體積（mL） ，m為稱取的樣品量（g） ，B為測(cè)定量取的體積（mL）。

2.4 單因素試驗(yàn) 選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C） 進(jìn)行單因素試驗(yàn)。分別改變乙醇濃度（55%，60%，65%，70%，75% ），料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35g·mL.-1），提取時(shí)間（30、45、60、75、90 min） 制備樣品液，計(jì)算總黃酮含量，考察各因素對(duì)總黃酮含量的影響。

2.5 正交試驗(yàn) 分別精密稱取樣品粉末9份，每份約1.0g，選取乙醇濃度A（%），料液比B（g·mL.-1），提取時(shí)間C（min）各3個(gè)水平進(jìn)行L9 （3.3） 正交試驗(yàn)，以提取的總黃酮含量（mg·g.-1）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察血當(dāng)歸總黃酮的最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

2.6 抗氧化活性測(cè)定 在最優(yōu)工藝條件下獲得血當(dāng)歸總黃酮，采用二倍稀釋法配制成 0.78、1.6、3.1、6.2、12.5、25、50、100、200、400、800mg·L.-1濃度梯度的樣品溶液備用。

2.6.1 DPPH·清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12-17]的方法略作優(yōu)化，在10 mL比色管中依次加入0.5 mmol·L.-1 DPPH·乙醇溶液2 mL、無水乙醇2 mL和不同濃度的樣品溶液2 mL，混勻，避光室溫放置30 min后，定容至10 mL，用無水乙醇代替樣品液做空白對(duì)照組，以無水乙醇進(jìn)行調(diào)零，在517 nm處分別測(cè)吸光度A0、A1、A2，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，陽性對(duì)照為抗壞血酸，抗壞血酸的濃度和樣品溶液濃度相同，同樣采用二倍稀釋法配制11組濃度梯度的抗壞血酸溶液。通過以下公式即可分別計(jì)算出樣品和抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率，并根據(jù)SPSS 19.0軟件計(jì)算出IC50值（即自由基清除率達(dá)到50%時(shí)樣品的濃度）。

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度，A1為加入樣品液所測(cè)得的吸光度，A2為用同體積無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液所測(cè)得的吸光度。

2.6.2 ABTS.+·清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15-17]的方法略做優(yōu)化，ABTS.+·儲(chǔ)備液：3.75 mmol·L.-1過硫酸鉀溶液和7.5 mmol·L.-1 ABTS溶液按1∶1混合，避光室溫下反應(yīng)17 h。ABTS.+·工作液：量取20.0 mL儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋，在734nm波長(zhǎng)下測(cè)定，使吸光度值達(dá)0.7±0.02，臨用新配。在10 mL比色管中依次精密加入ABTS.+·工作液3.0 mL和樣品溶液1.0 mL，混勻，用蒸餾水代替樣品液做空白對(duì)照組，避光靜置顯色10 min后，以蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，在734 nm波長(zhǎng)處，分別測(cè)定吸光值A(chǔ)0、A1、A2，重復(fù)3次。陽性對(duì)照為抗壞血酸，計(jì)算清除率和IC50。

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度，A1為加入樣品液所測(cè)得得吸光度，A2為用同體積蒸餾水代替ABTS.+·工作液所測(cè)得的吸光度。

2.6.3 清除·OH能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18-19]的方法略作優(yōu)化，在10 mL比色管中依次加入7.5 mmol·L.-1 FeSO4溶液1 mL、7.5 mmol·L.-1水楊酸乙醇溶液1 mL、60 mmol·L.-1 H2O2溶液1 mL和不同濃度的樣品溶液1 mL，搖勻，在37 ℃水浴加熱30 min，再用蒸餾水定容至10 mL，用蒸餾水代替樣品液做空白對(duì)照組。以蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，在510 nm波長(zhǎng)處，分別測(cè)吸光度值A(chǔ)0、A1、A2，重復(fù)3次，陽性對(duì)照為抗壞血酸，計(jì)算清除率和IC50。

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度，A1為加入樣品液所測(cè)得的吸光度，A2為用同體積蒸餾水代替H2O2溶液所測(cè)得的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 血當(dāng)歸總黃酮提取單因素考察的結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度對(duì)血當(dāng)歸總黃酮含量的影響 由圖1可見，血當(dāng)歸總黃酮含量隨乙醇濃度增大而增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到65%后，血當(dāng)歸總黃酮含量增大趨勢(shì)緩慢，因此，確定血當(dāng)歸總黃酮提取的最佳乙醇濃度為65%，正交試驗(yàn)乙醇濃度因素的3個(gè)水平選擇60%、65%和70%。

3.1.2 料液比對(duì)血當(dāng)歸總黃酮含量的影響 由圖2可知，當(dāng)料液比在1∶10～1∶25g·mL.-1時(shí)，總黃酮的含量隨料液比增大而增高，當(dāng)料液比為1∶25g·mL.-1時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高。而后，總黃酮含量隨著料液比的增大而減小，因此，確定血當(dāng)歸總黃酮提取的最佳料液比為1∶25g·mL.-1，正交試驗(yàn)料液比因素的3個(gè)水平選擇1∶20、1∶25、1∶30g·mL.-1。

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)血當(dāng)歸總黃酮含量的影響 由圖3可知，血當(dāng)歸總黃酮的含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)提取時(shí)間為60min后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量沒有明顯增大。因此，確定血當(dāng)歸總黃酮提取的最佳提取時(shí)間為60 min，正交試驗(yàn)提取時(shí)間因素的3個(gè)水平選擇45、60、75min。

3.2 血當(dāng)歸總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果 從表3可以看出，影響血當(dāng)歸總黃酮含量的提取因素大小順序?yàn)锽>C>A，即料液比>提取時(shí)間>乙醇濃度。再分析k值可知，血當(dāng)歸總黃酮最佳提取工藝方案為∶ A2B3C1。即乙醇濃度65%、料液比 1∶30g·mL.-1、提取時(shí)間45 min。在此條件下黃酮含量達(dá)90.01mg·g.-1，結(jié)果表明所選工藝合理、可行，可用于血當(dāng)歸總黃酮提取工藝。

3.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證所選提取條件的準(zhǔn)確和科學(xué)，按最佳提取工藝分別進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果所得血當(dāng)歸總黃酮平均含量為90.05mg·g.-1（RSD=0.59%，n=3），驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該提取工藝合理，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

3.4 血當(dāng)歸總黃酮對(duì)DPPH·清除能力的影響 由圖4可知，血當(dāng)歸總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率隨其濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到50 mg·L.-1后，DPPH·的清除率趨于平緩直線。從血當(dāng)歸總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH·清除率的IC50值來看，其強(qiáng)弱順序?yàn)椤?血當(dāng)歸總黃酮（ IC50 = 11.62mg·L.-1）>抗壞血酸（ IC50 = 15.80mg·L.-1）。當(dāng)濃度為0.78～25 mg·L.-1范圍內(nèi)，血當(dāng)歸總黃酮對(duì)DPPH·的清除率優(yōu)于抗壞血酸，說明血當(dāng)歸總黃酮抗氧化活性優(yōu)于抗壞血酸，具有良好的 DPPH·清除能力。

3.5 血當(dāng)歸總黃酮對(duì)ABTS.+·清除能力的影響 由圖5可知，血當(dāng)歸總黃酮和抗壞血酸對(duì)ABTS .+·的清除率隨其濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)12.5 mg·L.-1時(shí)，血當(dāng)歸總黃酮對(duì)ABTS .+·清除率是同濃度抗壞血酸的2.1倍。當(dāng)濃度達(dá)到25 mg·L.-1后，ABTS.+·的清除率就基本達(dá)到100%，從血當(dāng)歸總黃酮和抗壞血酸對(duì)ABTS.+·清除率的IC50值結(jié)果來看，其強(qiáng)弱順序?yàn)椤?血當(dāng)歸總黃酮（IC50 =1.83 mg·L.-1）>抗壞血酸（IC50=11.1 mg·L.-1），說明血當(dāng)歸總黃酮抗氧化活性優(yōu)于抗壞血酸，具有很好的ABTS .+·清除能力。

3.6 血當(dāng)歸總黃酮對(duì)·OH清除能力的影響 由圖6可知，血當(dāng)歸總黃酮和抗壞血酸對(duì)·OH的清除率隨濃度的增大而增大，血當(dāng)歸總黃酮和抗壞血酸對(duì)·OH清除率的IC50值分別為136.12mg·L.-1和334.58mg·L.-1，根據(jù)·OH清除曲線可以看出，高濃度的血當(dāng)歸總黃酮對(duì)·OH有很強(qiáng)的清除能力。

4 討論

本研究通過提取方法（超聲法和回流法）的考察，發(fā)現(xiàn)超聲法提取總黃酮含量比回流法更高，可能加熱后導(dǎo)致黃酮分解，其含量有所偏低，超聲法具有提取時(shí)間短、條件溫和、效率高、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)，最終確定采用超聲法提取血當(dāng)歸總黃酮。由于血當(dāng)歸中鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì)比較多，對(duì)測(cè)定的總黃酮含量存在一定的干擾，在提取總黃酮時(shí)加入了氫氧化鈣，可使藥材中的鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì)生成鈣鹽而沉淀，不被溶出，達(dá)到純化黃酮類化合物的效果。通過波長(zhǎng)掃描樣品和蘆丁對(duì)照品，發(fā)現(xiàn)樣品的最大吸收波長(zhǎng)在507 nm，而蘆丁對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)在510 nm，存在一定差異，可能樣品中的總黃酮還有一定的雜質(zhì)干擾，但通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)，樣品在波長(zhǎng)507 nm和510 nm處的吸光度相差很小，基本對(duì)測(cè)定結(jié)果沒有影響，最終確定測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm。為了找到提取總黃酮的最佳方法，以不同濃度乙醇為溶劑采用超聲法提取血當(dāng)歸總黃酮，分別考察了各單因素（乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間）對(duì)提取血當(dāng)歸總黃酮含量的影響，并通過L9 （3.3） 正交設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到各因素對(duì)總黃酮含量影響程度大小為∶ 料液比>提取時(shí)間>乙醇濃度，通過優(yōu)化得到血當(dāng)歸總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度65%，料液比1∶30g·mL.-1，提取時(shí)間45 min，總黃酮含量達(dá)90.05mg·g.-1。此條件下得到的血當(dāng)歸總黃酮清除DPPH·，ABTS.+·和·OH的能力良好，其IC50值分別為11.62、1.83、136.12 mg·L.-1，尤其對(duì)ABTS.+·清除能力最優(yōu)，表明血當(dāng)歸總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，并且血當(dāng)歸藥材中總黃酮含量較高，具有很高的藥用價(jià)值，值得綜合開發(fā)應(yīng)用。

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（收稿日期：2019-06-18 編輯：程鵬飛）