中華絨螯蟹致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定、藥敏特性及其組織病理學觀察

周慧華 黃曉東 安健 曹海鵬 楊先樂

摘要：【目的】查明引起江蘇省連云港市某養(yǎng)殖場中華絨螯蟹死亡的病原菌及其藥敏特性與組織病理特征，為該病的臨床診斷和藥物防控提供科學依據(jù)?！痉椒ā坎捎脗鹘y(tǒng)方法從患病中華絨螯蟹肝胰腺組織中分離病原菌，通過人工回歸感染試驗確定其致病性，利用API ID32E細菌生化鑒定試劑條和16S rRNA序列分析對病原菌進行鑒定，以紙片擴散法測定病原菌的藥敏特性，并通過常規(guī)石蠟切片觀察患病中華絨螯蟹肝胰腺和腸道等病灶組織的病理特征?！窘Y(jié)果】從患病中華絨螯蟹肝胰腺中分離獲得1株具有致病性的病原菌株（HXH1），經(jīng)生理生化特性鑒定和16S rRNA序列分析確定其為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）。HXH1菌株對健康中華絨螯蟹的半數(shù)致死劑量（LD50）為6.92×104 CFU/mL，對復(fù)方新諾明、桿菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、卡那霉素、磺胺異噁唑、鏈霉素和甲氧嘧啶等14種抗生素高度敏感，對羅紅霉素中度敏感，對多西環(huán)素、萘啶酸、阿莫西林、四環(huán)素和吡哌酸等5種抗生素已產(chǎn)生耐藥性（不敏感）。與健康中華絨螯蟹相比，患病中華絨螯蟹的肝胰腺和腸道存在明顯病理變化，具體表現(xiàn)為：肝胰腺細胞排列極其紊亂，局部可見壞死細胞，細胞核固縮深染;局部腸黏膜上皮組織溶解脫落至腸腔內(nèi)。【結(jié)論】維氏氣單胞菌對中華絨螯蟹具有較強的致病性，通過引起肝胰腺和腸道等器官組織的病理變化而造成機體損傷甚至死亡，養(yǎng)殖生產(chǎn)上可選用喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和酰胺醇類漁用抗生素進行防治。

關(guān)鍵詞： 中華絨螯蟹;維氏氣單胞菌;分離鑒定;藥敏特性;組織病理特征

中圖分類號： S945.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1851-09

Isolation， identification and antibiotic susceptibility of pathogenic Aeromonas veronii in Eriocheir sinensis and its histopathological observations

ZHOU Hui-hua1，2，3， HUANG Xiao-dong1，2，3， AN Jian4， CAO Hai-peng1，2，3*，

YANG Xian-le1，2，3

（1National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306， China;

2Shanghai Engineering Research Center for Aquaculture（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306， China;

3Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 4Lianyungang City Oceanic and Fishery Development Center， Lianyungang， Jiangsu? 222000， China）

Abstract：【Objective】The present study was conducted to investigate the bacterial pathogen that caused the death of Eriocheir sinensis farmed in Lianyungang， Jiangsu and determine its antibiotic susceptibility and histopathological characterization in order to provide reference for clinical diagnosis and effective control of this disease in E. sinensis aquaculture.【Method】Bacterial isolates were isolated from naturally infected E. sinensis using traditional methods and the pathogenicity was determined by artificial infection test. The pathogenic isolate was identified by API ID32E biochemical identification reagent strip and 16S rRNA sequence analysis. Its antibiotic susceptibility was tested by disc diffusion method， and the histopathological characterization of pancreas and intestinal tract the diseased E. sinensis was further observed by conventional paraffin section technique. 【Result】The pathogenic strain HXH1 was isolated from hepatopancreas of diseased E. sinensis and was identified as Aeromonas veronii based on phenotypic characteristics and 16S rRNA sequences analysis. It had an median lethal dose（LD50） of 6.92×104 CFU/mL for healthy E. sinensis and showed high susceptibility to compound sulfamethoxazole， bacitracin， netilmicin， florfenicol， polymixin B， neomycin， gentamycin， ofloxacin， norfloxacin， enrofloxacin， kanamycin， sulfisoxazole， streptomycin， trimethoprim， moderate susceptibility to roxithromycin and resistant（insensitivity） to doxycycline， nalidixic acid， amoxicillin， tetracycline and pipemidic acid. In addition， compared with healthy E. sinensis， the hepatopancreas and intestinal tract of diseased E. sinensis had obvious pathological change. The hepatopancreas cells of diseased E. sinensis were irregular-arranged， appeared local necrosis with pyknotic nucleus， local epithelial tissues of intestinal mucosa were dissolved and fell off into the intestinal cavity. 【Conclusion】A. veronii has high pathogenicity for E. sinensis which induces the body damages and even death by causing pathological changes in hepatopancreas and intestine， fishery quinolones， aminoglycosides， sulfonamides and amphenicols antibiotics can be used as a reference for the control of this disease.

Key words： Aeromonas veronii; Eriocheir sinensis; isolation and identification; antibiotic susceptibility; histopa-thological characterization

0 引言

【研究意義】中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，年產(chǎn)量已超過81萬t（農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，2017），具有很高的養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，但隨著養(yǎng)殖密度和規(guī)模的不斷擴大，細菌性病害對中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)生了嚴重危害，且呈現(xiàn)出病原菌種類多、繁殖速度快、致病力強和發(fā)病率高的特點，通常引起中華絨螯蟹內(nèi)臟組織出現(xiàn)不同程度的損傷而導(dǎo)致大規(guī)模死亡（徐欣等，2003）。因此，加強細菌性病害研究對促進中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是一種對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害極大的致病菌，可導(dǎo)致斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）（黃小麗等，2010）、齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）（謝光美等，2015）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（王興麗等，2016）、中華鱘（Acipenser sinensis）（田甜等，2017）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（張小明等，2017）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）（高彩霞等，2018）、達氏鱘（Acipenser dabryanus）（劉亞等，2018）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkia）（彭博文等，2018）、臺灣泥鰍（Paramisgurnus dabryanus spp. Taiwan）（徐先棟等，2018）、鯽（Carassius auratus）（朱潛等，2018）和泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）（袁雪梅等，2018）等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)生嚴重病害，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前，國內(nèi)外有關(guān)水產(chǎn)動物維氏氣單胞菌的流行特點、臨床特征、分類地位、耐藥性、致病機理及免疫防控等方面已有較多研究報道（康雪微等，2017;高彩霞等，2018;康元環(huán)等，2018;Song et al.，2018;Li et al.，2019），但其病理診斷基礎(chǔ)較薄弱，僅系統(tǒng)闡明斑點叉尾鮰（黃小麗等，2010）、齊口裂腹魚（謝光美等，2015）、虹鱒（王興麗等，2016）和達氏鱘（劉亞等，2018）等少數(shù)水產(chǎn)動物維氏氣單胞菌病的組織病理特征，尤其隨著漁用抗生素的不合理使用，水產(chǎn)動物致病性維氏氣單胞菌的耐藥性日益增強，在一定程度上嚴重影響了水產(chǎn)動物維氏氣單胞菌病的防控效果?！颈狙芯壳腥朦c】2018年8月江蘇省連云港市某養(yǎng)殖場的中華絨螯蟹出現(xiàn)嚴重病情，其臨床特征主要表現(xiàn)為病蟹行動遲緩，攝食減少或不攝食，肝胰腺呈暗黃色，腸道有膿狀黏液，與已報道的中華絨螯蟹維氏氣單胞菌病病癥（房海等，2008;鄭世雄，2013;姜光明等，2016）不完全相同，因此急需鑒定其病原并科學用藥以減少經(jīng)濟損失。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對患病中華絨螯蟹進行病原菌分離鑒定、毒力檢測及藥敏試驗，并觀察其組織病理特征，以期為該病的臨床診斷和藥物防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

自然發(fā)病中華絨螯蟹取自江蘇省連云港市某養(yǎng)殖場，共16只，平均體重114.6 g/只;健康中華絨螯蟹由上海市某養(yǎng)殖場提供，共200只，大小均勻、體質(zhì)健壯，平均體重20.1 g/只。API ID32E細菌生化鑒定試劑條（法國梅里埃公司產(chǎn)）和藥敏紙片（杭州濱河微生物試劑有限公司產(chǎn)）購自上海傲之珊實業(yè)發(fā)展有限公司。

1. 2 病原菌分離

參照曹海鵬等（2015）的方法，對自然發(fā)病中華絨螯蟹進行病原菌的分離與純化，并觀察分離菌株培養(yǎng)獲得的菌落形態(tài)特征及菌體形態(tài)。

1. 3 人工回歸感染試驗

人工回歸試驗設(shè)5個試驗組和1個對照組，每組10只健康中華絨螯蟹。試驗前參照曹海鵬等（2015）的方法制備分離菌株菌懸液，其中，試驗組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射1.0×107 CFU/mL的菌懸液（徐海圣等，2002），注射劑量0.1 mL/只;對照組中華絨螯蟹注射等量無菌生理鹽水。試驗周期為7 d，養(yǎng)殖水溫控制在28 ℃，每天觀察中華絨螯蟹的病癥及記錄其死亡數(shù)量，并及時撈出死蟹再次進行病原菌分離，確定其致病性。

1. 4 病原菌鑒定

采用API ID32E細菌生化鑒定試劑條對病原菌株進行生理生化鑒定（李莉等，2015），并對分離菌株進行16S rRNA序列PCR擴增及測序分析（房海等，2008），最后采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，通過16S rRNA序列分析對分離菌株進行分子鑒定。

1. 5 病原菌毒力測定

試驗設(shè)4個試驗組和1個對照組，每組10只健康中華絨螯蟹。試驗組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射8.7×103～8.7×106 CFU/mL的分離菌株菌懸液（徐海圣等，2002），注射劑量0.1 mL/只;對照組中華絨螯蟹注射等量無菌生理鹽水。試驗周期為7 d，養(yǎng)殖水溫控制在28 ℃，每天觀察中華絨螯蟹的病癥及記錄其死亡數(shù)量，及時撈出死蟹再次進行病原菌分離鑒定，并依據(jù)概率單位圖解法測定分離菌株對中華絨螯蟹的半數(shù)致死劑量（LD50）。

1. 6 病原菌藥敏特性測定

采用紙片擴散法測定分離菌株的藥敏特性（Joseph et al.，2011），并根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》判定分離菌株對各抗生素的敏感度。

1. 7 組織病理觀察

取患病中華絨螯蟹的肝胰腺和腸道等病灶組織，以健康中華絨螯蟹的相應(yīng)組織為對照，通過常規(guī)病理組織學方法（楊宗英等，2018）制備石蠟組織切片，經(jīng)HE染色后于光學顯微鏡下進行觀察比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離結(jié)果

從患病中華絨螯蟹的肝胰腺中共分離獲得5株疑似病原菌株，暫命名為HXH1、HXH2、HXH3、HXH4和HXH5。人工回歸感染試驗結(jié)果表明，僅HXH1菌株感染中華絨螯蟹后出現(xiàn)死亡，累計死亡率達100%（表1），其臨床癥狀與自然發(fā)病中華絨螯蟹的病癥（圖1）基本一致，且從人工感染發(fā)病中華絨螯蟹肝胰腺中可再次分離到與HXH1菌株生理生化特性一致的菌株，由此判定HXH1菌株是引起中華絨螯蟹發(fā)病的病原菌。HXH1菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，米白色，中央略微隆起，不透明，革蘭氏染色呈陰性，菌體呈桿狀（圖2）。

2. 2 病原菌鑒定結(jié)果

由表2可知，HXH1菌株的生理生化鑒定結(jié)果與維氏氣單胞菌（A. veronii）對照菌株（高彩霞等，2018;袁雪梅等，2018）的生理生化特征基本一致。通過BLASTn對HXH1菌株與GenBank中已知菌株的16S rRNA序列進行同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HXH1菌株的16S rRNA序列（GenBank登錄號MK033596）與GenBank中已公布維氏氣單胞菌代表菌株的16S rRNA序列自然聚類，其同源性為99%～100%（表3）。此外，基于菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）也顯示，HXH1菌株與維氏氣單胞菌HL-7株（GenBank登錄號KF413417）的親緣關(guān)系最近。綜合生理生化鑒定結(jié)果及16S rRNA序列分析結(jié)果，可判定HXH1菌株為維氏氣單胞菌（A. veronii）。

2. 3 病原菌毒力測定結(jié)果

將HXH1菌株配制成8.7×103～8.7×106 CFU/mL的菌懸液，然后分別注射感染健康中華絨螯蟹，至試驗第7 d中華絨螯蟹的累計死亡率為20%～100%（表4），而注射無菌生理鹽水的中華絨螯蟹未出現(xiàn)任何病癥和死亡現(xiàn)象，從人工感染發(fā)病死亡中華絨螯蟹的肝胰腺內(nèi)可分離獲得與HXH1菌株生理生化特征一致的菌株，說明試驗中華絨螯蟹的發(fā)病死亡為HXH1菌株感染所致。根據(jù)概率單位圖解法建立的死亡概率（y）與菌懸液濃度對數(shù)（x）關(guān)系曲線方程為y=0.8416x+0.9269（R2=0.9707），即HXH1菌株對健康中華絨螯蟹的LD50為6.92×104 CFU/mL。

2. 4 病原菌的藥敏特性

HXH1菌株對20種抗生素的藥敏試驗結(jié)果（表5）表明，HXH1菌株對復(fù)方新諾明、桿菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、卡那霉素、磺胺異噁唑、鏈霉素和甲氧嘧啶等14種抗生素高度敏感，對羅紅霉素中度敏感，對多西環(huán)素、萘啶酸、阿莫西林、四環(huán)素和吡哌酸等5種抗生素已產(chǎn)生耐藥性（不敏感），與維氏氣單胞菌代表菌株（房海等，2008;高彩霞等，2018;彭博文等，2018;袁雪梅等，2018）對復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、卡那霉素、磺胺異噁唑、鏈霉素、甲氧嘧啶和阿莫西林等抗生素的敏感性一致。

2. 5 患病中華絨螯蟹的組織病理特征

與健康中華絨螯蟹相比，患病中華絨螯蟹的肝胰腺和腸道存在明顯病理變化，具體表現(xiàn)為：患病中華絨螯蟹肝胰腺細胞排列極其紊亂，局部可見壞死細胞，細胞核固縮深染（圖4）;局部腸黏膜上皮組織溶解脫落至腸腔內(nèi)（圖5）。

3 討論

維氏氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），廣泛分布于水體、淤泥和水生生物體內(nèi)，是一種人—畜—水生動物共患致病菌（宋明芳等，2018），具有強致病性，但其感染中華絨螯蟹后的臨床癥狀各不相同，有的表現(xiàn)為腹腔內(nèi)有積水、鰓呈暗灰色、肝胰腺呈淺黃色（房海等，2008），有的表現(xiàn)為軟殼、黑鰓、腹腔內(nèi)有積水、腸內(nèi)無食（鄭世雄，2013），有的表現(xiàn)為鰓絲排列不整齊、肝胰腺淡黃、腸內(nèi)無食、血液凝固緩慢或不凝固（姜光明等，2016），而本研究中的患病中華絨螯蟹表現(xiàn)為病蟹行動遲緩，攝食減少或不攝食，肝胰腺呈暗黃色，腸道有膿狀黏液。因此，明確中華絨螯蟹維氏氣單胞菌病的病理特征對提高其防控水平具有重要意義。

維氏氣單胞菌不同菌株間通常存在明顯的毒力差異。徐洋等（2015）分離獲得的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）致病性維氏氣單胞菌H0426株的LD50為3.98×104 CFU/mL，張小明等（2017）分離獲得的凡納濱對蝦致病性維氏氣單胞菌AVZ01株的LD50為8.7×105 CFU/mL，康雪微等（2017）分離出的金魚（Carassius auratus）致病性維氏氣單胞菌KL-1株的LD50為1.4×107 CFU/mL，而本研究分離自中華絨螯蟹的維氏氣單胞菌HXH1菌株的LD50為6.92×104 CFU/mL，其毒力明顯高于維氏氣單胞菌AVZ01和KL-1株。據(jù)報道，維氏氣單胞菌的致病性通常與其氣溶素、溶血素、腸毒素、酪蛋白酶、酯酶、淀粉酶和卵磷脂酶等相關(guān)毒力因子的分泌及表達密切相關(guān)（宋明芳等，2018），即維氏氣單胞菌不同菌株間的毒力差異可能與其攜帶的毒力因子種類和數(shù)量不同有關(guān)。此外，不同來源的維氏氣單胞菌還存在理化特性差異，如加州鱸（Micropterus salmoides）源致病性維氏氣單胞菌（龍波等，2016）和泥鰍源致病性維氏氣單胞菌（袁雪梅等，2018）表現(xiàn)出不同的纖維二糖發(fā)酵特性，可能與維氏氣單胞菌不同菌株所處的地理差異或生長環(huán)境不同有關(guān)（李小波和黃文芳，2003）。因此，維氏氣單胞菌的鑒定方法通常需在生理生化鑒定的基礎(chǔ)上進行16S rRNA序列分析鑒定（李莉等，2015）。本研究綜合生理生化鑒定與16S rRNA序列分析結(jié)果，確定引起江蘇省連云港市某養(yǎng)殖場中華絨螯蟹發(fā)病死亡的病原菌（HXH1菌株）為維氏氣單胞菌。

肝胰腺不同程度壞死是中華絨螯蟹維氏氣單胞菌病的常見病癥（房海等，2008;姜光明等，2016）。已有研究表明，引起中華絨螯蟹肝胰腺壞死的病因可分為細菌性（孫修云和宮子慧，2017）和非生物性（陸宏達等，2017）兩種類型。陸宏達等（2017）、楊宗英等（2018）研究認為，中華絨螯蟹非生物性肝胰腺壞死是以肝胰腺出現(xiàn)水腫或萎縮為主要病理特征，且隨著病情的加重，肝胰腺組織中單層上皮細胞空泡化嚴重，肝胰腺細胞排列紊亂，肝胰腺細胞壞死、細胞核固縮、胞質(zhì)崩解。至今，有關(guān)中華絨螯蟹細菌性肝胰腺壞死的組織病理特征鮮見報道。本研究對維氏氣單胞菌引起的中華絨螯蟹病理組織進行觀察，發(fā)現(xiàn)患病中華絨螯蟹的肝胰腺細胞排列極其紊亂，局部可見壞死細胞，細胞核固縮深染，但與中華絨螯蟹非生物性肝胰腺壞死不同的是肝胰腺并未出現(xiàn)明顯的水腫或萎縮等病理特征。因此，通過檢測肝胰腺是否出現(xiàn)明顯的水腫或萎縮等病理癥狀，可有效區(qū)分中華絨螯蟹非生物性肝胰腺壞死和細菌性肝胰腺壞死。

近年來，雖然基于中藥和益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技術(shù)研究已取得顯著進展，但由于這些抗生素替代品存在應(yīng)用效果不穩(wěn)定、成本較高及基礎(chǔ)理論研究不完善等問題（王熙濤等，2015），因此科學選擇和使用抗生素仍是細菌性疾病防控的主要手段。本研究的藥敏試驗結(jié)果表明，HXH1菌株對恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考和磺胺異噁唑等漁用抗生素高度敏感，可作為臨床用藥的依據(jù)。此外，HXH1菌株與房海等（2008）分離獲得的中華絨螯蟹源維氏氣單胞菌對復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星和卡那霉素等抗生素均高度敏感，但對桿菌肽、多西環(huán)素和四環(huán)素等抗生素的敏感特性存在明顯差異，與姜光明等（2016）分離獲得的中華絨螯蟹源維氏氣單胞菌對磺胺類抗生素的敏感特性也有差異，說明中華絨螯蟹源維氏氣單胞菌不同菌株間也存在藥敏特性差異。因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中對中華絨螯蟹維氏氣單胞菌病進行藥物防控時必須有針對性地進行藥敏篩選試驗，選擇最有效的藥物以減輕病原菌的耐藥性，提高病害的防控效果。

4 結(jié)論

維氏氣單胞菌對中華絨螯蟹具有較強的致病性，通過引起肝胰腺和腸道等器官組織的病理變化而造成機體損傷甚至死亡，養(yǎng)殖生產(chǎn)上可選用喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和酰胺醇類漁用抗生素進行防治。

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（責任編輯 蘭宗寶）