急性氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)抗氧化酶活性及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉雨 丁煒東 曹哲明 邴旭文 徐暢 楊帆 張晨光 谷心池 孫阿君

摘要：【目的】從抗氧化酶活性和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平揭示氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）幼魚(yú)機(jī)體的毒性效應(yīng)機(jī)制，為其健康養(yǎng)殖與水質(zhì)調(diào)控管理提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā刻暨x規(guī)格整齊、體表無(wú)損傷的翹嘴鱖幼魚(yú)進(jìn)行96 h急性氨氮脅迫試驗(yàn)，在獲得半致死濃度（LC50）的基礎(chǔ)上，將翹嘴鱖幼魚(yú)暴露于48.65 mg/L的水體氨氮下，以完全曝氣的自來(lái)水（氨氮實(shí)測(cè)值為0.05 mg/L）為對(duì)照組，分別于脅迫0、6、12、24、48和96 h后測(cè)定抗氧化酶活性及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】翹嘴鱖幼魚(yú)的96 h-LC50為48.65 mg/L（非離子氨0.47 mg/L）。翹嘴鱖幼魚(yú)在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中，其肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）含量均呈先升高后降低的變化趨勢(shì);脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）在肝臟中的累積量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，至脅迫96 h時(shí)達(dá)最高值（0.50 μmol/g），顯著高于對(duì)照組（P<0.05，下同）。與對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)相比，經(jīng)氨氮脅迫后翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β和IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量均呈升高—降低—升高的變化趨勢(shì)，于脅迫6 h起顯著上調(diào)，分別于脅迫12和96 h時(shí)達(dá)最高值;TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量整體上呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在脅迫6 h時(shí)顯著低于對(duì)照組，但至脅迫96 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值;IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫96 h時(shí)均顯著高于對(duì)照組;HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，至脅迫96 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組?！窘Y(jié)論】氨氮脅迫初期，翹嘴鱖幼魚(yú)抗氧化系統(tǒng)被誘導(dǎo)激活，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào);至脅迫后期，翹嘴鱖幼魚(yú)抗氧化功能受抑制，而炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)持續(xù)上調(diào)。說(shuō)明持續(xù)炎癥反應(yīng)及抗氧化系統(tǒng)功能受抑制是翹嘴鱖氨氮中毒死亡的主要原因。

關(guān)鍵詞： 翹嘴鱖;氨氮脅迫;抗氧化酶;炎癥反應(yīng)相關(guān)基因;96 h半致死濃度（96 h-LC50）

中圖分類(lèi)號(hào)： S965.127? ? ? ? ? ? &nbsp; ? ? ? &nbsp; ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1860-09

Effects of acute ammonia nitrogen stress on antioxidant enzymes activity and gene expression involved in inflammation

of juvenile Siniperca chuatsi

LIU Yu1， DING Wei-dong2， CAO Zhe-ming2， BING Xu-wen2*， XU Chang1，2，

YANG Fan1，2， ZHANG Chen-guang1，2， GU Xin-chi1， SUN A-jun2

（1Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi， Jiangsu? 214081，China; 2Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi， Jiangsu? 214081， China）

Abstract：【Objective】In this study， antioxidant enzyme activity and expression level of genes involved in inflammation were studied to reveal the toxicity mechanism of juvenile Siniperca chuatsi under ammonia nitrogen stress to provide scientific basis for healthy breeding and water quality control management. 【Method】Undamaged juvenile S. chuatsi similar to each other in size were selected for 96 h acute ammonia nitrogen stress experiments. Using the obtained half lethal concentration（LC50） of ammonia-nitrogen in S. chuatsi as a basic concentration，the juvenile S. chuatsi were exposed to 48.65 mg/L concentration of ammonia nitrogen in water for 96 h. Fully aerated tap water（measured ammonia nitrogen value was 0.05 mg/L） was as control group. The activity of antioxidant enzymes and the expression of genes involved in inflammation were measured at 0， 6， 12， 24， 48? and 96 h respectively after stress. 【Result】The 96 h-LC50 of juvenile S. chuatsi was 48.65 mg/L（nonionic ammonia 0.47 mg/L）. In this study， the superoxide dismutase（SOD） activity， catalase （CAT） activity and glutathione（GSH） content in the liver of the experimental group have a tendency of increasing first and then decreasing. The accumulation of lipid peroxide（LPO） in liver increased gradually with the prolongation of stress time， and reached the maximum value at 96 h（0.50 μmol/g）， which was significantly higher than the control group（P<0.05， the same below）. Compared with control group， the relative expression of IL-1β and IL-8 genes in the liver of juvenile S. chuatsi presented up-down-up trend after ammonia nitrogen stress， and was significantly increased after 6 h stress， and peaked at 12 and 96 h after stress. The relative expression of TNF-α gene presented down-up trend as a whole， and was significantly lower than control after 6 h of stress， and reached the peak at 96 h. At 96 h of stress effect， the relative expressions of IL-1β and IL-8， TNF-α genes were all significantly higher than that of the control group. There was a tendency of increasing first then decreasing in the relative expression of HSP90α gene. After 96 h of stress effect， the relative expression of HSP90α gene was significantly lower than that of the control group. 【Conclusion】In the early stage of stress， the antioxidant system of juvenile S. chuatsi is induced to activation and the relative expression of inflammation-related genes up-regulates. However， in the late stage of stress， antioxidant function is inhibited and the relative expression of inflammation-related genes continue up-regulating. It is suggested that continuous inflammatory reaction and inhibition of antioxidant system may lead to the death of S. chuatsi exposed to ammonia nitrogen.

Key words： Siniperca chuatsi; ammonia nitrogen stress; antioxidant enzymes; inflammation-related genes; 96 h half lethal concentration（96 h-LC50）

0 引言

【研究意義】水體中的氨氮構(gòu)成主要包括離子氨（NH4+）和非離子氨（NH3）兩種形式，且主要來(lái)源于食物殘?jiān)?dòng)植物生長(zhǎng)代謝及死亡個(gè)體分解等（徐楊等，2015）。氨氮主要是以NH3的形式經(jīng)魚(yú)鰓、表皮和腸黏膜等組織進(jìn)入魚(yú)體，氨氮中毒會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)速度遲緩、免疫水平低下，同時(shí)伴有氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步誘發(fā)各種疾?。ㄕ颅偟?，2015;付瑩和趙玉蓉，2018）。因此，探究氨氮對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性效應(yīng)與耐受限度，分析氨氮脅迫下魚(yú)類(lèi)的生理生化指標(biāo)及相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律，對(duì)揭示氨氮脅迫對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性作用機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著生物體內(nèi)氨氮含量的升高，不僅導(dǎo)致腦腫脹，還能誘導(dǎo)生成具有神經(jīng)毒性的NO（Veauvy et al.，2005）。NO促使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，同時(shí)生成對(duì)機(jī)體危害性更強(qiáng)的NO2，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體細(xì)胞呼吸障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Rodrigo et al.，2009;Braissant et al.，2013）。黃云（2013）、劉永波和王雅倩（2016）研究表明，氨氮脅迫下魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、免疫水平低下甚至大批量死亡現(xiàn)象。Zhang等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）在氨氮中毒的情況下其肝臟抗氧化與炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)。此外，大量研究表明暴露于高濃度氨氮環(huán)境中的魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)不同程度肝臟細(xì)胞腫大或空泡化等損傷壞死現(xiàn)象（Sitp-Bobadilla and Alvarez-Pellitero，2009;張武肖等，2015），嚴(yán)重影響肝臟的生理機(jī)能。在羅非魚(yú)（Oreochroms mossambcus）（強(qiáng)俊等，2011）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）（姜會(huì)民，2012）、草魚(yú)（Grass carp）（周鑫等，2013）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）（周瑩等，2016）、尖吻鱸（Latescal carifer）（劉亞娟等，2018）的相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫能誘導(dǎo)抗氧化相關(guān)酶活性呈規(guī)律性變化，整體上表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制。【本研究切入點(diǎn)】翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）隸屬于鱸形目（Perciformes）真鱸科（Percichthyidae）鱖屬（Siniperca），為兇猛的肉食性魚(yú)類(lèi)，具有肉質(zhì)鮮美、高蛋白低脂肪等特點(diǎn)，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的特種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（吳斌等，2015;顏元杰等，2019）。近年來(lái)，翹嘴鱖野生資源銳減與優(yōu)質(zhì)魚(yú)類(lèi)蛋白需求劇增間的矛盾不斷擴(kuò)大，促使翹嘴鱖規(guī)?；B(yǎng)殖得到快速發(fā)展，因此如何科學(xué)調(diào)控翹嘴鱖養(yǎng)殖水體氨氮水平已成為健康養(yǎng)殖管理的重點(diǎn)內(nèi)容之一。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探究急性氨氮脅迫下翹嘴鱖幼魚(yú)的抗氧化酶活性及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律，從酶活性和基因表達(dá)水平揭示氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)機(jī)體的毒性效應(yīng)機(jī)制，為其健康養(yǎng)殖與水質(zhì)調(diào)控管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)用魚(yú)

翹嘴鱖幼魚(yú)取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院南泉養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)于室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（400 L/桶）。選取體表無(wú)損傷、規(guī)格整齊的翹嘴鱖幼魚(yú)300尾，試驗(yàn)開(kāi)始前在室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)14 d，暫養(yǎng)期間保持自然光照周期，暫養(yǎng)水體條件：溶氧≥6 mg/L、氨氮≤0.05 mg/L、水溫（22±0.5）℃、pH 7.8±0.5。暫養(yǎng)期間以1～2 g/尾的鳊魚(yú)幼魚(yú)為餌料，每2 d投放1次，投喂量為翹嘴鱖體重的2倍。

1. 2 氨氮脅迫96 h半致死濃度（96 h-LC50）測(cè)試

于室內(nèi)控溫循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)14 d后，選取規(guī)格整齊的翹嘴鱖幼魚(yú)120尾（13.55±0.69 g/尾）進(jìn)行半致死濃度（LC50）測(cè)試。設(shè)0、30、60和90 mg/L NH4Cl四個(gè)梯度濃度，每組濃度3個(gè)平行，每個(gè)平行放10尾幼魚(yú)。在96 h觀測(cè)期間保持水體靜止，停止進(jìn)食，持續(xù)充氧[溶解氧（DO）=6.28±0.10 mg/L]，水溫（22±0.5）℃，pH 7.6±0.3，每隔8 h使用W-1型多參數(shù)水質(zhì)分析儀（杭州陸恒生物科技有限公司）檢測(cè)水體氨氮濃度，以10 g/L NH4Cl母液調(diào)整至試驗(yàn)設(shè)計(jì)的氨氮濃度，每隔24 h換水1/4。觀測(cè)翹嘴鱖幼魚(yú)的活動(dòng)變化情況，計(jì)數(shù)并撈出死亡個(gè)體（魚(yú)體側(cè)翻且鰓蓋停止扇動(dòng)視為死亡）。

1. 3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

暫養(yǎng)結(jié)束后，依據(jù)96 h-LC50設(shè)對(duì)照組（0 mg/L）和試驗(yàn)組（48.65 mg/L），選取體質(zhì)量相近、活性良好的翹嘴鱖幼魚(yú)180尾（13.31±0.49 g/尾）隨機(jī)平均放入6個(gè)400 L養(yǎng)殖桶中（試驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)平行），每桶30尾魚(yú)。對(duì)照組為完全曝氣的自來(lái)水（氨氮實(shí)測(cè)值為0.05 mg/L）。氨氮脅迫時(shí)長(zhǎng)為96 h，期間保持水體靜止，停止進(jìn)食，持續(xù)充氧（DO=6.13±0.12 mg/L），水溫（22±0.5）℃，pH 7.7±0.5，每隔8 h使用W-1型多參數(shù)水質(zhì)分析儀檢測(cè)水體氨氮濃度，以10 g/L NH4Cl母液調(diào)整至試驗(yàn)設(shè)計(jì)的氨氮濃度，每隔24 h換水1/4。在氨氮脅迫0、6、12、24、48和96 h時(shí)，每桶分別隨機(jī)選擇3尾翹嘴鱖并用50 mg/L MS-222進(jìn)行輕度麻醉，采集幼魚(yú)活體的肝臟用生理鹽水漂洗，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用宋美澤等（2018）的方法提取肝臟總RNA，即采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供的RNApure Tissue Kit試劑盒進(jìn)行提取，然后使用HIFIscript cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的IL-1β、IL-8、HSP90α和TNF-α基因開(kāi)放閱讀框序列，以β-actin為管家基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Primer-BLAST程序中完成引物設(shè)計(jì)，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上、下游各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 8.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán);60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 抗氧化酶活性檢測(cè)

過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。取0.1 g肝臟樣品加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，研磨成組織勻漿，4 ℃下3000 r/min離心10 min，制備待測(cè)樣本，然后按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，以BioTek EonTM微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)讀數(shù)。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

翹嘴鱖幼魚(yú)96 h-LC50分析采用直線內(nèi)插法，以SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 翹嘴鱖幼魚(yú)96 h-LC50測(cè)定結(jié)果

翹嘴鱖幼魚(yú)暴露于不同氨氮梯度濃度水體后均出現(xiàn)躁動(dòng)不安、四處游動(dòng)的應(yīng)激反應(yīng)，且應(yīng)激反應(yīng)時(shí)間及程度隨氨氮濃度的升高而加劇。氨氮脅迫后期，翹嘴鱖幼魚(yú)尾鰭不同程度地向內(nèi)側(cè)弓起，尤其在90 mg/L NH4Cl試驗(yàn)組中尾鰭與身體幾乎成直角，魚(yú)體游動(dòng)遲緩，對(duì)應(yīng)的死亡率（96.67%）（表2）也顯著高于其他處理組（P<0.05，下同）。氨氮脅迫96 h后統(tǒng)計(jì)死亡的翹嘴鱖幼魚(yú)個(gè)體，通過(guò)直線內(nèi)插法計(jì)算得出翹嘴鱖幼魚(yú)的96 h-LC50為48.65 mg/L（非離子氨0.47 mg/L）。

2. 2 急性氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟抗氧化相關(guān)酶活性的影響

2. 2. 1 SOD活性 如圖1所示，對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟SOD活性無(wú)顯著變化（P>0.05，下同），試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中其肝臟SOD活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。氨氮脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟SOD活性顯著升高，至脅迫12 h時(shí)肝臟SOD活性達(dá)最高值（396.00 U/mg），是對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)的1.34倍，隨后呈明顯的下降趨勢(shì)，至脅迫96 h時(shí)已顯著低于對(duì)照組。

2. 2. 2 CAT活性 如圖2所示，對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟CAT活性無(wú)顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中其肝臟CAT活性呈降低—升高—降低的變化趨勢(shì)。氨氮脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟CAT活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但脅迫12 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟CAT活性顯著高于對(duì)照組，且呈持續(xù)升高趨勢(shì);至脅迫48 h時(shí)肝臟CAT活性達(dá)最高值（77.09 U/mg），是對(duì)照組的1.75倍，隨后開(kāi)始下降，至脅迫96 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟CAT活性仍顯著高于對(duì)照組。

2. 2. 3 GSH含量 如圖3所示，對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟GSH含量無(wú)顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中其肝臟GSH含量變化趨勢(shì)與CAT活性相似。氨氮脅迫12 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟GSH含量顯著高于對(duì)照組，且呈持續(xù)升高趨勢(shì);脅迫至24 h時(shí)肝臟GSH含量達(dá)最高值（88.84 μmol/g），是對(duì)照組的1.57倍，隨后開(kāi)始下降，至脅迫96 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟GSH含量顯著低于對(duì)照組。

2. 2. 4 LPO含量 如圖4所示，對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟LPO含量無(wú)顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中其肝臟LPO含量整體上呈逐漸升高趨勢(shì)。氨氮脅迫12 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟LPO含量顯著高于對(duì)照組，隨后肝臟LPO含量持續(xù)升高，至脅迫96 h時(shí)達(dá)最大值（0.50 μmol/g），是對(duì)照組的3.77倍。

2. 3 急性氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

2. 3. 1 IL-1β基因 在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量呈升高—降低—升高的變化趨勢(shì)（圖5）。氨氮脅迫12 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，隨后呈下降趨勢(shì)，至脅迫96 h時(shí)肝臟IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量再次上調(diào);從氨氮脅迫6 h起，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。

2. 3. 2 IL-8基因 如圖6所示，對(duì)照組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化，而試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量在急性氨氮脅迫過(guò)程中呈明顯升高—降低—升高的變化趨勢(shì)。氨氮脅迫12 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)第一個(gè)峰值，但至脅迫24 h時(shí)肝臟IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量降至最低值，顯著低于對(duì)照組，隨后再次上調(diào)，至脅迫96 h時(shí)肝臟IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)至最高值，是對(duì)照組的1.71倍。

2. 3. 3 TNF-α基因 在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量整體上呈先降低后升高的變化趨勢(shì)（圖7）。氨氮脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，顯著低于對(duì)照組，隨后肝臟TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)，至脅迫96 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量上調(diào)至最高值，是對(duì)照組的1.63倍。

2. 3. 4 HSP90α基因 在96 h的急性氨氮脅迫過(guò)程中，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖8）。氨氮脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，至脅迫12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量上調(diào)至最高值，是對(duì)照組的4.08倍;隨后開(kāi)始逐漸下調(diào)，至脅迫96 h時(shí)翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。

3 討論

3. 1 急性氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)的毒性效應(yīng)

氨氮是養(yǎng)殖水質(zhì)檢測(cè)的重要指標(biāo)之一，氨氮水平升高會(huì)對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)造成生長(zhǎng)抑制、代謝紊亂、組織損傷及免疫力低下等不良影響，甚至造成魚(yú)類(lèi)死亡（付瑩和趙玉蓉，2018）。不同魚(yú)類(lèi)對(duì)氨氮暴露脅迫的耐受上限存在明顯差異，斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）幼魚(yú)的96 h-LC50為5.13 mg/L（鄭樂(lè)云，2012），大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）幼魚(yú)的96 h-LC50為1.25 mg/L（阮成旭等，2014），團(tuán)頭魴幼魚(yú)的96 h-LC50為56.49 mg/L（張武肖等，2015），鯽魚(yú)幼魚(yú)的96 h-LC50為0.73 mg/L（Wang et al.，2017），大彈涂魚(yú)（Boleophthalmus pectinirostris）幼魚(yú)的96 h-LC50為8.99 mg/L（宋美澤等，2018）。本研究結(jié)果表明，翹嘴鱖幼魚(yú)的96 h-LC50為48.65 mg/L（非離子氨0.47 mg/L），與團(tuán)頭魴幼魚(yú)（張武肖等，2015）相近，但高于斜帶石斑魚(yú)（鄭樂(lè)云，2012）、大黃魚(yú)（阮成旭等，2014）、鯽魚(yú)（Wang et al.，2017）和大彈涂魚(yú)（宋美澤等，2018）的幼魚(yú)。翹嘴鱖幼魚(yú)的氨氮耐受程度較高，可能與其肉食性且棲于水體底層的生活習(xí)性有關(guān)。魚(yú)體規(guī)格差異也可能導(dǎo)致其氨氮耐受限度不同。劉建魁等（2014）、李之鄉(xiāng)等（2017）在史氏鱘（Acipenser schrencki）幼魚(yú)和大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼魚(yú)的氨氮毒性研究中發(fā)現(xiàn)，96 h-LC50與幼魚(yú)的體質(zhì)量呈正相關(guān)。本研究檢測(cè)的翹嘴鱖幼魚(yú)體質(zhì)量為13.55±0.69 g/尾，可能是導(dǎo)致其96 h-LC50較高的原因之一，但具體原因尚有待進(jìn)一步探究。

3. 2 急性氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟抗氧化相關(guān)酶活性的影響

在良好的水質(zhì)環(huán)境中，魚(yú)類(lèi)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可有效清除生理代謝活動(dòng)生成的活性氧自由基（ROS）。當(dāng)水體中氨氮濃度升高時(shí)，魚(yú)體內(nèi)發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生大量ROS，當(dāng)ROS含量超出抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)閾值時(shí)，機(jī)體即出現(xiàn)氧化損傷，甚至死亡（胡靜等，2016）。SOD、CAT和GSH等是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，抗氧化系統(tǒng)通過(guò)三者的協(xié)同作用以降低氧化應(yīng)激所造成的損傷（陶易凡等，2016）。本研究結(jié)果表明，抗氧化酶SOD、CAT活性和抗氧化物質(zhì)GSH含量在急性氨氮脅迫過(guò)程中均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。氨氮脅迫12 h時(shí)，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟SOD和CAT活性及GSH含量升高，且均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明氨氮脅迫初期水質(zhì)環(huán)境中其含量變化引起翹嘴鱖幼魚(yú)體內(nèi)的ROS含量增加，誘導(dǎo)SOD、CAT活性和GSH含量升高，提高機(jī)體的抗氧化防御能力而及時(shí)清除過(guò)多的ROS，以維持代謝平衡;脅迫24 h后，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟SOD活性和GSH含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，脅迫48 h后CAT活性也開(kāi)始回落，至脅迫96 h時(shí)翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟SOD活性和GSH含量均顯著低于對(duì)照組，可能是隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)體內(nèi)ROS含量已超出抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)閾值，肝臟組織受到氨氮毒性影響，而抑制抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)合成，抗氧化功能被削弱，與胡毅等（2012）、Jia等（2017）的研究報(bào)道一致。在本研究中，SOD、CAT和GSH三者具有協(xié)同作用，但對(duì)急性氨氮脅迫的應(yīng)激響應(yīng)速度并未同步，可能與三者在氧化應(yīng)激防御體系中所承擔(dān)的功能不同有關(guān)。

LPO是ROS作用于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)，其含量能反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平和細(xì)胞損傷程度，同時(shí)間接反映機(jī)體的ROS含量（何吉祥等，2016;祁紅學(xué)等，2017）。本研究結(jié)果表明，氨氮脅迫6 h時(shí)，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟LPO含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明在氨氮脅迫初期，SOD、CAT活性和GSH含量顯著上升，機(jī)體內(nèi)的氧化自由基能被及時(shí)清除;氨氮脅迫48 h后，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟LPO含量急劇上升，說(shuō)明隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)體內(nèi)ROS含量急劇上升，同時(shí)SOD活性與GSH含量顯著低于對(duì)照組，即抗氧化系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致LPO含量急劇增加。

3. 3 急性氨氮脅迫對(duì)翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

隨著機(jī)體內(nèi)氨氮濃度不斷升高，魚(yú)類(lèi)常出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、肝臟病變及免疫水平降低等不良反應(yīng);同時(shí)，高濃度氨氮能突破血腦屏障，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫大，激活N-甲基-D天冬氨酸受體而誘發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡（Zhang et al.，2018）。Qi等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低濃度的氨氮脅迫可誘導(dǎo)鯉魚(yú)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（TNF-α和IL-1β）的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，氨氮脅迫6 h后，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β和IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明脅迫初期在外源性氨氮的毒性作用下，魚(yú)體代謝平衡受到干擾并產(chǎn)生毒性興奮效應(yīng)，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制啟動(dòng)抗氧化防御及一系列修復(fù)機(jī)制的同時(shí)，上調(diào)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)（Xing et al.，2016）;但脅迫12～24 h期間，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明炎癥反應(yīng)相關(guān)基因大量表達(dá)并招募白細(xì)胞以應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)，為避免持續(xù)的炎癥反應(yīng)錯(cuò)誤破壞正常組織器官生理代謝平衡，魚(yú)體能適時(shí)調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)（Li et al.，2016），與宋美澤等（2018）的研究結(jié)論一致;但脅迫48 h后，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量再次顯著上調(diào)，可能與過(guò)度氨氮暴露導(dǎo)致的ROS與炎癥因子累積有關(guān)，與Cheng等（2015）的研究報(bào)道一致。Chandra等（2000）研究指出，雖然機(jī)體生理調(diào)節(jié)機(jī)制能修復(fù)應(yīng)激損傷，但應(yīng)激水平超過(guò)調(diào)節(jié)閾值時(shí)，將誘發(fā)代謝紊亂及細(xì)胞凋亡等不良反應(yīng)。持續(xù)氨氮脅迫導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS不僅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能引發(fā)炎癥反應(yīng)，激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)表達(dá)一系列炎癥反應(yīng)相關(guān)基因，誘發(fā)線粒體自噬與細(xì)胞凋亡進(jìn)而應(yīng)激致死（Ai et al.，2011;Jia et al.，2014）。

熱休克蛋白（HSPs）是生物體在應(yīng)激條件下產(chǎn)生具有抗逆性的應(yīng)激蛋白（金曄等，2018），其中，HSP90α在多種脅迫條件下均能誘導(dǎo)表達(dá)，因此常作為評(píng)估生物應(yīng)激水平的生物標(biāo)志物（劉童，2015;賈利興，2016）。本研究結(jié)果表明，氨氮脅迫6 h時(shí)，翹嘴鱖幼魚(yú)肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，提示機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平不斷升高，而誘導(dǎo)HSP90α基因表達(dá)上調(diào)以修復(fù)受損細(xì)胞與變性蛋白;至脅迫12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量上調(diào)至最高值，隨后HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，可能與機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇且超出機(jī)體調(diào)節(jié)閾值有關(guān)。過(guò)度的氧化應(yīng)激與炎癥因子積累可能導(dǎo)致機(jī)體免疫水平下降及新陳代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，機(jī)體自我修復(fù)功能下降，與王蕓等（2013）的研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

氨氮脅迫初期，翹嘴鱖幼魚(yú)抗氧化系統(tǒng)被誘導(dǎo)激活，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào);至脅迫后期，翹嘴鱖幼魚(yú)抗氧化功能受抑制，而炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)持續(xù)上調(diào)。說(shuō)明持續(xù)炎癥反應(yīng)及抗氧化系統(tǒng)功能受抑制是翹嘴鱖氨氮中毒死亡的主要原因。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）