菜粉蝶HSP20基因的克隆及溫度脅迫下表達(dá)分析

袁遠(yuǎn) 張連根 高熹

摘要：【目的】克隆分析菜粉蝶（Pieris rapae）熱激蛋白20基因（HSP20），并檢測其在溫度脅迫下的表達(dá)情況，為探析菜粉蝶適應(yīng)溫度脅迫機(jī)制提供參考?！痉椒ā恳圆朔鄣麨樵囼?yàn)材料，采用RT-PCR和RACE克隆獲得菜粉蝶HSP20基因cDNA全長，并通過生物學(xué)軟件分析其序列，明確其基因結(jié)構(gòu)特征和親緣關(guān)系;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測菜粉蝶HSP20基因在低溫（-20～0 ℃）和高溫（5～45 ℃）脅迫下的表達(dá)響應(yīng)。【結(jié)果】菜粉蝶HSP20基因全長725 bp，5'-端非編碼區(qū)105 bp，3'-端非編碼區(qū)109 bp，開放閱讀框531 bp，編碼176個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量19.5 kD，理論等電點(diǎn)6.61;其編碼氨基酸序列中含有1個(gè)典型的HSP20家族結(jié)構(gòu)域（位于第60～142位氨基酸）、1個(gè)α-晶體蛋白（位于第60～157位氨基酸）和1個(gè)Allato allatostatin（位于第14～24位氨基酸）;基序列相似度分析其與二化螟、家蠶和甘藍(lán)夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度較高并聚為一族。該基因隨環(huán)境溫度的升高或降低發(fā)生變化，在-5和40 ℃誘發(fā)該基因高效表達(dá)?！窘Y(jié)論】低溫和高溫均能誘導(dǎo)菜粉蝶HSP20基因高效表達(dá)。

關(guān)鍵詞： 菜粉蝶;熱激蛋白;HSP20;基因克隆;序列分析;溫度脅迫;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S433.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）02-0286-06

Abstract：【Objective】Heat shock protein 20 gene（HSP20） from Pieris rapae was cloned and its expression under temperature stress was detected. The result was helpful for further investigation of the adaptation mechanisms of P. rapae to high and low temperature stresses. 【Method】Full length cDNA of HSP20 gene of P. rapae was cloned by RT-PCR and RACE with P. rapae as materials. Its sequence was analyzed by biology software， and its gene structural sequence and genetic relationship were also studied. Response of HSP20 gene to low（-20-0 ℃） and high （5-45 ℃） temperatures were ana-lyzed by fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full-length of P. rapae HSP20 was 725 bp， and contained 105 bp 5'-noncoding region， 109 bp 3'-noncoding region， a 531 bp open reading frame（ORF），encoded 176 amino acids， with an estimated molecular mass of 19.5 kD and an theoretical isoelectric point（pI） of 6.61. In the encoded amino acid sequences， there was one typical HSP20 family domain（located at 60-142 amino acids）， one α-crystallin（located at 60-157 amino acids） and a Allato allatostatin（located at 14-24 amino acids）. The sequence similarities between P. rapae HSP20 and that of? Chilo suppressalis， Bombyx mori， Mamestra brassicae were high and they were clustered into one group. The HSP20 expressions changed with temperature， and high expressions of this gene was observed at -5 and 40 ℃. 【Conclusion】Low and high temperatures can lead to the high expression of P. rapae HSP20.

Key words： Pieris rapae; heat shock protein; HSP20; gene cloning; sequence analysis; temperature stress; expression analysis

0 引言

【研究意義】熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）又稱應(yīng)激蛋白或熱休克蛋白，是生物有機(jī)體遇到高溫等逆境刺激后大量產(chǎn)生的一類特定的應(yīng)急蛋白，是生物體對(duì)逆境脅迫適應(yīng)的重要組成成分，其普遍參與生物的各種生理代謝途徑，對(duì)減輕逆境脅迫對(duì)自身的傷害起重要作用。HSP普遍存在于各種生物體內(nèi)，對(duì)生物個(gè)體的生長、發(fā)育和生存發(fā)揮著重要作用（韓政等，2010;代玲玲等，2011;徐劍文等，2017;張響英等，2017）。隨著全球氣溫的持續(xù)升高，高溫脅迫對(duì)昆蟲及其他生物的影響也越來越大，通過研究熱激蛋白調(diào)控細(xì)胞使昆蟲適應(yīng)外界脅迫的機(jī)制，對(duì)揭示生物應(yīng)對(duì)全球溫室效應(yīng)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，對(duì)于HSP尚無明確的分類標(biāo)準(zhǔn)，普遍認(rèn)同Morimoto的劃分方法，他將主要的HSP分為4個(gè)家族：HSP90（83～90 kD）、HSP70（66～78 KD）、HSP60和小分子HSP（15～30 kD）家族（Lindquist，1986）。近年來，已有系列文獻(xiàn)報(bào)道各種昆蟲HSP基因的克隆、表達(dá)分析及其功能鑒定研究，但這些研究主要集中在熱休克蛋白家族的HSP70和HSP90，而針對(duì)小分子熱休克蛋白的研究相對(duì)較少。HSP20是生物體應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的主要蛋白質(zhì)之一。多數(shù)應(yīng)激反應(yīng)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受損，HSP20能夠結(jié)合損傷的蛋白質(zhì)，并預(yù)防胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，同時(shí)能遷移到核仁中，與細(xì)胞內(nèi)的核糖體建立聯(lián)系，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞核蛋白質(zhì)的作用。不同物種的HSP20基因具有高度保守的氨基酸序列，該特征亦為生物進(jìn)化研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)（Mehlen et al.，1996）。目前，已報(bào)道在家蠶（Bombyx mori）、小菜蛾（Plutella xylostella）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）和二化螟（Chilo suppressalis）等昆蟲中分離克隆出許多小分子HSP基因，這些基因在昆蟲生長發(fā)育、生殖和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用（Li et al.，2009;Shen et al.，2011;夏曉峰等，2013;張青等，2014;Liu et al.，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】菜粉蝶（Pieris rapae）隸屬鱗翅目（Lepioloptera）粉蝶科（Pierididae），分布于世界各地，主要危害甘藍(lán)和白菜等十字花科植物。菜粉蝶對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力極強(qiáng)，無論是在炎熱的夏季還是寒冷的冬季均能生存。目前，有關(guān)菜粉蝶HSP20基因的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RACE-PCR從菜粉蝶中克隆HSP20基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的菜粉蝶HSP20基因序列特征進(jìn)行分析，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測在不同溫度下該基因的表達(dá)情況，為深入揭示菜粉蝶對(duì)溫度脅迫適應(yīng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試菜粉蝶幼蟲采集于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場甘藍(lán)蔬菜地。主要試劑和藥品：TRIzol試劑購自Invitrogen公司，Advantage 2 PCR Kit（Clontech）和Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司，pGEM?-T載體購自Promega公司，Taqman-MGB探針購自上海GeneCore生物技術(shù)公司。

1. 2 RNA抽提

采用TRIzol試劑提取菜粉蝶總RNA，分別用紫外分光光度計(jì)和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量（Tachibana et al.，2005）。

1. 3 HSP20基因克隆

以提取的菜粉蝶總RNA為模板，用Smarttm RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）合成3'-和5'-RACE cDNA模板。根據(jù)對(duì)菜粉蝶cDNA文庫測序得到HSP20基因片段序列，設(shè)計(jì)3'-RACE（5'-GGTG AATTTGGATGTCCAGCATTTCACT-3'）和5'-RACE（5'-CCTAGGAGCAATGACGGTCAGAACGCCAT-3'）引物。以RACE cDNA為模板，擴(kuò)增菜粉蝶HSP20基因的中間片段序列。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。

根據(jù)擴(kuò)增獲得的菜粉蝶HSP20基因中間片段序列，設(shè)計(jì)其3'-RACE和5'-RACE引物，結(jié)合RACE試劑盒中的UPM引物（Universal Primer A Mix，UPM），PCR擴(kuò)增獲得該基因的3'-和5'-端序列。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。采用Advantage 2 PCR Kit（Clontech）進(jìn)行PCR。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測，切膠并用AxyAprep DNA凝膠回收試劑盒（Biosciences）回收，將回收產(chǎn)物連接到pGEM?-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選（Sonoda et al.，2006a）。將得到的陽性克隆菌液送金思特科技（南京）有限公司測序。

1. 4 基因序列分析

用Genetyx Ver. 8.0分析菜粉蝶HSP20基因核序列酸，推導(dǎo)氨基酸序列。用ClustalX（v1.83）程序進(jìn)行多序列對(duì)比，用Motif scan對(duì)該序列中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測（Rinehart et al.，2000）。

1. 5 溫度脅迫下HSP20基因表達(dá)分析

將菜粉蝶蟲體分別置于低溫（-20、-15、-5和0 ℃）和高溫（5、25、30、35、40和45 ℃）下1 h，每個(gè)溫度值作為一個(gè)處理，其中室溫25 ℃作為對(duì)照。合成的菜粉蝶cDNA作實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測模板。用Primer 5.0設(shè)計(jì)定量引物（5'-ACTCGTGACCTTG GCTCCA-3'和5'-CCCTCTACCACGATGTATC-3'），以18S RNA為內(nèi)參（5'-CAGTGATGGGATGAGTGC TTT-3'，R：5'-TACGCTATTGGAGCTGGAATT-3'），參照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）說明進(jìn)行定量擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)用 2-△△Ct方法進(jìn)行分析（Livak and Schmittgen， 2001），基因表達(dá)量差異采用SPSS 20.0中的最小顯著差法（LSD）檢驗(yàn)，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菜粉蝶HSP20基因序列分析結(jié)果

圖1結(jié)果顯示，菜粉蝶HSP20基因全長725 bp，5'-端非編碼區(qū)105 bp，3'-端非編碼區(qū)109 bp，開放閱讀框（Open reading frame，ORF）531 bp，編碼176個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量19.5 kD，理論等電點(diǎn)（pI）6.61。該基因具有多聚腺苷酸信號(hào)（AATAAA），出現(xiàn)在核苷酸序列終止密碼子下游68 bp處，且有ploy（A）尾巴。

通過Motif sacn分析（Sonoda et al.，2006b）發(fā)現(xiàn)，該蛋白中存在3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（SIK60～62、SVK83～85和TRR112～114）、2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（TPDD26～29和TPEE78～81）、1個(gè)典型的HSP20家族結(jié)構(gòu)域（位于第60～142位氨基酸）、1個(gè)a-晶體蛋白（位于第60～157位氨基酸）和1個(gè)Allato Allatostatin（位于第14～24位氨基酸）。

2. 2 菜粉蝶HSP20蛋白同源性分析結(jié)果

菜粉蝶與其他昆蟲的HSP20蛋白氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果見圖2。菜粉蝶與其他昆蟲HSP20蛋白的氨基酸相似度比較結(jié)果（表1）顯示，菜粉蝶與二化螟（C. suppressalis）、家蠶（B. mori）、甘藍(lán)夜蛾（Mamestra brassicae）、云杉卷葉蛾（Choristoneura fumiferana）、小菜蛾（P. xylostella）、東亞飛蝗（Locusta migratoria）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、腰帶長體繭蜂（Macrocentrus cingulum）和美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）的HSP20蛋白氨基酸相似度分別為85%、84%、84%、72%、57%、48%、51%、46%和43%。

應(yīng)用MEGA 4.0鄰接法（NJ）對(duì)菜粉蝶和其他昆蟲的HSP20蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）顯示，菜粉蝶HSP20蛋白氨基酸序列以95%的支持率與家蠶、二化螟和甘藍(lán)夜蛾聚為一族。

2. 3 溫度脅迫下菜粉蝶HSP20基因的表達(dá)分析結(jié)果

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析菜粉蝶HSP20基因在低溫和高溫脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）顯示，低溫條件下菜粉蝶HSP20基因的表達(dá)量明顯升高，在-5 ℃時(shí)達(dá)峰值，是對(duì)照組的1.76倍;高溫條件下，在40 ℃時(shí)表達(dá)量明顯升高，是對(duì)照組的2.75倍，差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。表明低溫和高溫脅迫均誘導(dǎo)菜粉蝶體內(nèi)HSP20基因的高效表達(dá)。

3 討論

HSP普遍存在于自然界的原核生物和真核生物中，其進(jìn)化上相對(duì)保守。適宜條件下，其多數(shù)是作為分子伴侶幫助蛋白質(zhì)正確折疊、移位、維持特定構(gòu)象或參與蛋白質(zhì)降解（任莉萍和曹小漢， 2006）。當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境刺激時(shí)，HSP基因的表達(dá)量常會(huì)大幅度提升，參與生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持、更新、修復(fù)和免疫等環(huán)節(jié)，以提高生物體抵抗外來刺激的能力。鑒于HSP的免疫保護(hù)作用對(duì)生物有重要意義，因此一直是研究的熱點(diǎn)（李斌，2001;申建茹等，2011;張青等，2014）。目前，已有系列文獻(xiàn)報(bào)道各種昆蟲HSP基因克隆、表達(dá)分析及初步功能鑒定研究（Multhoff，2007），但這些研究主要集中在HSP家族的HSP70和HSP90，而對(duì)小分子HSP的研究相對(duì)較少，已報(bào)道的僅有果蠅、家蠶和斜紋夜蛾等（寇利花等，2015）。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展及測序成本的降低，將鑒定出越來越多的昆蟲小分子HSP基因序列，而這些序列的鑒定將揭示該類蛋白在昆蟲中的進(jìn)化過程，為昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供新視野，同時(shí)為后續(xù)研究昆蟲小分子HSP的功能提供必要基礎(chǔ)。

本研究以其他昆蟲HSP20基因保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增菜粉蝶HSP20基因的中間片段，然后利用RACE技術(shù)獲得全長cDNA。克隆得到的菜粉蝶HSP20基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，菜粉蝶HSP20基因全長725 bp，5'-端非編碼區(qū)105 bp，3'-端非編碼區(qū)109 bp，開放性閱讀框531 bp，編碼176個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量19.5 kD，理論等電點(diǎn)6.61。經(jīng)結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，菜粉蝶HSP20蛋白中具有1個(gè)典型的HSP20家族結(jié)構(gòu)域，可判斷其屬于HSP20家族成員。此外，Motif scan分析發(fā)現(xiàn)該菜粉蝶HSP20基因存在3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，而蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主導(dǎo)作用，推測這幾個(gè)位點(diǎn)可能是HSP20基因完成其生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);同源性分析結(jié)果顯示，菜粉蝶HSP20蛋白以95%的支持率與家蠶、二化螟和甘藍(lán)夜蛾聚為一族，說明HSP20基因在進(jìn)化中具有高度的保守性;通過氨基酸序列比對(duì)得知，該基因5'-端在物種進(jìn)化過程中保守性低。這些特征均與迄今已克隆獲得的其他昆蟲HSP20基因結(jié)構(gòu)特征相似（Mehlen et al.，1996;Wang et al.，2012）。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析菜粉蝶HSP20基因在低溫脅迫下的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的下降表達(dá)量明顯升高，在-5 ℃時(shí)菜粉蝶HSP20基因的表達(dá)量明顯升高至峰值，隨后開始降低;高溫脅迫下，隨著溫度的升高表達(dá)量明顯提高，在40 ℃時(shí)菜粉蝶HSP20基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)峰值，隨后開始降低。菜粉蝶HSP20基因的克隆分析為后續(xù)該蟲的熱激機(jī)制及對(duì)溫度的脅迫適應(yīng)機(jī)制研究提供分子生物學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步開展相關(guān)后續(xù)研究打下理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

菜粉蝶HSP20基因具有1個(gè)典型的HSP20家族結(jié)構(gòu)域，存在3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，與家蠶、二化螟和甘藍(lán)夜蛾的HSP20基因有較高的同源性。環(huán)境溫度脅迫能誘導(dǎo)HSP20基因大量表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）