唐古特莨菪中生物堿的分離鑒定與殺蟲(chóng)活性研究

王玉靈 郭致杰 胡冠芳 李國(guó)鋒 牛樹(shù)君 趙峰

摘要 本文采用MCI柱層析、硅膠柱層析等天然產(chǎn)物分離方法，從唐古特莨菪地上部甲醇粗提物中分離得到了2個(gè)莨菪烷類(lèi)生物堿單體。通過(guò)化合物特征反應(yīng)，質(zhì)譜、碳譜和氫譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鑒定了其結(jié)構(gòu)，分別為樟柳堿和山莨菪堿。采用微量點(diǎn)滴法和玻片浸漬法測(cè)定了2種生物堿對(duì)甘藍(lán)蚜等6種常見(jiàn)蚜蟲(chóng)和朱砂葉螨等4種常見(jiàn)葉螨處理24 h的觸殺活性，結(jié)果表明，樟柳堿對(duì)豆蚜、棉蚜、麥長(zhǎng)管蚜和山莨菪堿對(duì)棉蚜具有較強(qiáng)的觸殺活性，處理24 h的LC50依次為0.495、0.429、0.881和0.404 mg/mL，其活性均高于對(duì)照藥劑魚(yú)藤酮或與其相當(dāng)，相對(duì)毒力分別為魚(yú)藤酮的1.246、1.017、1.168和1.078倍;樟柳堿對(duì)朱砂葉螨、二斑葉螨和山莨菪堿對(duì)朱砂葉螨、二斑葉螨具有較強(qiáng)的觸殺活性，處理24 h的LC50依次為0.484、0.446和0.331、0.430 mg/mL，其活性均高于魚(yú)藤酮，相對(duì)毒力分別為魚(yú)藤酮的1.136、1.154和1.662、1.198倍。

關(guān)鍵詞 唐古特莨菪; 莨菪烷類(lèi)生物堿; 分離鑒定; 殺蟲(chóng)活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S 482.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018330

生物堿是自然界中廣泛存在的一大類(lèi)堿性含氮化合物，具有廣泛的生理活性[1]，往往是許多中草藥及藥用植物的有效成分[2]。生物堿的發(fā)現(xiàn)起始于19世紀(jì)初，是人們研究最早且最多的一類(lèi)天然有機(jī)化合物，迄今為止，從植物中分離出的生物堿大約有5 000多種[3]，《全國(guó)醫(yī)藥產(chǎn)品大全》收載的生物堿藥物及其制劑有62種，臨床應(yīng)用的生物堿也有80余種[4]。由于諸多生物堿具有抗腫瘤、抗菌、低毒性和成本低的特性，因而受到人們極大的關(guān)注[56]。在植物源農(nóng)藥的研制中，生物堿作為極具開(kāi)發(fā)潛質(zhì)的一個(gè)大類(lèi)而被廣泛重視和應(yīng)用[7]。截至目前，一些生物堿因具有殺蟲(chóng)抑菌等活性而被開(kāi)發(fā)為農(nóng)藥產(chǎn)品，如煙堿（nicotine）、苦參堿（matrine）、喜樹(shù)堿（camptothecin）、小檗堿（berberine）、百部堿（stemonine）及藜蘆堿（veratrine）[8]等。

唐古特莨菪Anisodus tanguticus （Maxim.） Pascher是我國(guó)特有的一種茄科Solanaceae山莨菪屬Anisodus多年生草本高山植物，主要分布于青海、西藏以及四川和甘肅的部分地區(qū)，在藏藥和中草藥領(lǐng)域研究應(yīng)用較廣[912]。近年來(lái)，隨著對(duì)唐古特莨菪有效成分研究的不斷深入，認(rèn)識(shí)到莨菪烷類(lèi)生物堿化合物是唐古特莨菪中主要的生物活性成分。莨菪烷類(lèi)生物堿在臨床上具有抗膽堿、麻醉、活血化瘀等多種功效[5，6，13]，但其作為農(nóng)藥活性分子的研究報(bào)道甚少。張興等[14]、張國(guó)洲等[15]、胡冠芳等[16]研究了唐古特莨菪對(duì)赤擬谷盜Tribolium castaneum、菜青蟲(chóng)Pieris rapae、黏蟲(chóng)Mythimna separata、

麥長(zhǎng)管蚜Sitobion miscanthi等害蟲(chóng)的生物活性，但只停留在粗提物階段，尚未涉及活性化合物單體研究。鑒于此，作者前期結(jié)合活性示蹤，從唐古特莨菪地上部分甲醇粗提物中分離獲得了2個(gè)莨菪烷類(lèi)生物堿化合物單體，分別為莨菪堿hyoscyamine和東莨菪堿scopolamine，并測(cè)定了其殺蚜、殺螨活性，結(jié)果顯示，莨菪堿對(duì)豆蚜Aphis craccivora、禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi、桃蚜Myzus persicae和棉蚜A.gossypii具有較強(qiáng)的觸殺活性，東莨菪堿對(duì)豆蚜和禾谷縊管蚜具有較強(qiáng)的觸殺作用;莨菪堿和東莨菪堿對(duì)截形葉螨Tetranychus truncatus、山楂葉螨Amphitetranychus viennensis、二斑葉螨T.urticae和朱砂葉螨T. cinnabarinus具有較強(qiáng)的觸殺作用，2種生物堿對(duì)4種葉螨的毒力相當(dāng)，均表現(xiàn)出對(duì)二斑葉螨和朱砂葉螨的毒力高于截形葉螨和山楂葉螨[1718]。

基于莨菪堿和東莨菪堿對(duì)蚜蟲(chóng)和葉螨具有較強(qiáng)的觸殺活性，本課題組對(duì)唐古特莨菪中的生物堿進(jìn)行了再次分離鑒定，以期得到更多的生物堿單體，為進(jìn)一步完善莨菪烷類(lèi)生物堿活性數(shù)據(jù)，指導(dǎo)莨菪烷類(lèi)生物堿結(jié)構(gòu)優(yōu)化與衍生物合成，發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)的新化合物，創(chuàng)制新型高效、低毒、低殘留植物源農(nóng)藥提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 活性成分分離鑒定

1.1.1 供試材料、試劑與儀器

供試材料：唐古特莨菪于2016年7月中旬采自甘南藏族自治州臨潭縣海拔為3 420 m的天然草地。取其地上部莖、葉及青果（未成熟果實(shí)），洗凈切碎，自然陰干，粉碎過(guò)40目篩，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑與儀器：魚(yú)藤酮（rotenone）、樟柳堿（anisodine）、山莨菪堿（anisodamine）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威科技有限公司。柱層析硅膠（48～75 μm）、薄層層析硅膠（GF254）、小孔樹(shù)脂凝膠MCI CHP 20P（75～150 μm）均由青島海洋化工廠(chǎng)生產(chǎn)。乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為分析純。BrukerAPEXⅡ質(zhì)譜儀和BrukerDRX400核磁共振波譜儀，由德國(guó)Bruker公司生產(chǎn);ZF7c三用紫外分析儀，由上?？等A生化儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 活性成分提取與分離方法

稱(chēng)取2.2 kg唐古特莨菪植物粉末，用甲醇浸提3次（時(shí)間依次為72、48、24 h），合并濾液，減壓濃縮至膏狀，懸浮于蒸餾水中，用4 mol/L HCl調(diào)懸浮液pH=1～2，靜置過(guò)夜，抽濾，再用4 mol/L NaOH調(diào)懸浮液pH=9～10，靜置過(guò)夜，用氯仿等體積萃取，減壓濃縮，回收氯仿，得到唐古特莨菪總生物堿150 g。

將150 g總生物堿用MCI柱（填料約3.5 L樹(shù)脂）層析，用甲醇∶乙腈∶水（16∶4∶80、26∶4∶70、36∶4∶60、46∶4∶50）依次洗脫，薄層檢測(cè)并收集相同流段，共得到A、B、C、D 4個(gè)組分，參照標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)生物堿成分存在于B、C組分內(nèi)。

將B組分浸膏25.3 g硅膠柱層析，用氯仿甲醇（含1‰三乙胺）梯度（40∶1、30∶1、20∶1、10∶1）洗脫，后用甲醇沖柱。以每1 000 mL的流出液作為分段，每個(gè)分段蒸除溶劑后用薄層層析硅膠板檢測(cè)，合并TLC顯示結(jié)果一樣或者相近的流段，共得到5個(gè)組分：B-Fr1（40∶1）、B-Fr2（30∶1）、B-Fr3（30∶1～20∶1）、B-Fr4（20∶1～10∶1）、B-Fr5（氯仿、甲醇沖柱）。將組分B-Fr3（氯仿∶甲醇=30∶1～20∶1，約6.7 g）用丙酮石油醚（1∶1）溶解，用硅膠濕法拌樣柱層析，用石油醚丙酮（含2%氨水）梯度（8∶1、4∶1、2∶1、1∶1）洗脫，得到4個(gè)組分：B-Fr3-1、B-Fr3-2、B-Fr3-3、B-Fr3-4，將B-Fr3-2（2.1 g）用硅膠濕法拌樣，以石油醚∶丙酮（2∶1，1∶1，0.5∶1）梯度洗脫，得化合物2。

將C組分浸膏19.5 g用硅膠濕法上柱，氯仿甲醇（含1‰三乙胺）梯度（30∶1，20∶1，10∶1）洗脫，后用甲醇沖柱。以每1 000 mL流出液作為分段，每個(gè)分段蒸除溶劑后用薄層檢測(cè)，將TLC顯示結(jié)果一樣或者相近的流段合并，共得到4個(gè)組分：C-Fr1（30∶1）、C-Fr2（20∶1）、C-Fr3（20∶110∶1）、C-Fr4（10∶1）。將組分C-Fr3（氯仿∶甲醇=5∶1，約6.1 g）用氯仿甲醇（10∶1）溶解，用硅膠濕法拌樣柱層析，用氯仿甲醇（含2%氨水）梯度（20∶1，10∶1，5∶1，2.5∶1）洗脫，依據(jù)TLC檢測(cè)得到4個(gè)組分：C-Fr3-1、C-Fr3-2、C-Fr3-3、C-Fr3-4，將C-Fr3-2（3.2 g）用硅膠濕法拌樣，以反向硅膠柱進(jìn)行層析純化，在甲醇水條件下進(jìn)行梯度（10∶1，5∶1，2.5∶1）洗脫，得化合物4。

1.2 殺蚜殺螨活性測(cè)定

1.2.1 供試蚜蟲(chóng)與葉螨

甘藍(lán)蚜Brevicoryne brassicae、麥長(zhǎng)管蚜S.miscanthi、豆蚜A.craccivora、禾谷縊管蚜R.padi、桃蚜M.persicae和棉蚜A.gossypii分別采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院不施藥的甘藍(lán)Brassica oleracea田、小麥Triticum aestivum田、蠶豆Vicia faba田、玉米Zea mays田、油菜Brassica napus田和棉花Gossypium hirsutum田。朱砂葉螨T.cinnabarinus、二斑葉螨T.urticae、截形葉螨T.truncatus及山楂葉螨Amphitetranychus viennensis分別采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院不施藥的大豆Glycine max、菜豆Phaseolus vulgaris、桃樹(shù)Prunus persica或蘋(píng)果樹(shù)Malus pumila葉片上。

1.2.2 供試藥劑濃度設(shè)置

樟柳堿、山莨菪堿和對(duì)照藥劑魚(yú)藤酮均用丙酮水（9∶1）溶解，并加入1%表面活性劑JFC（C7～C9烷醇聚氧乙烯醚）。依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將樟柳堿、山莨菪堿測(cè)定濃度在166.7～4 000.0 mg/L之間設(shè)置5個(gè)不同梯度濃度。溶劑對(duì)照及藥劑對(duì)照均按處理的同等梯度濃度設(shè)置。

1.2.3 殺蚜殺螨活性測(cè)定方法

對(duì)蚜蟲(chóng)的觸殺作用測(cè)定參照已報(bào)道的權(quán)威經(jīng)典測(cè)試方法—點(diǎn)滴法[19]。挑選大小一致的無(wú)翅成蚜，用0.046 μL的微量點(diǎn)滴器將藥液點(diǎn)滴在蚜蟲(chóng)的前胸背板上，置于已放入新鮮寄主植物葉片并鋪有濾紙保濕的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，每皿放30頭蚜蟲(chóng)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。以等量的丙酮水+JFC用蒸餾水稀釋成同樣濃度作為溶劑對(duì)照，以相同方法配制不同濃度梯度的魚(yú)藤酮作為藥劑對(duì)照。在溫度（25±1）℃、濕度60%～80%、L∥D=14 h∥10 h條件下飼養(yǎng)，24 h后檢查死亡數(shù)，計(jì)算死亡率、校正死亡率及相對(duì)毒力。用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸及方差分析，得毒力回歸方程（Y=A+BX），致死中濃度LC50及95%置信限。

死亡率=（死亡蟲(chóng)數(shù)/處理蟲(chóng)數(shù)）×100%;

校正死亡率=[（處理死亡率-對(duì)照死亡率）/（100-對(duì)照死亡率）]×100%;

相對(duì)毒力=對(duì)照藥劑的LC50/供試藥劑的LC50。

對(duì)葉螨的觸殺作用測(cè)定采用FAO推薦的玻片浸漬法[20]。用毛筆挑選大小一致、體色鮮艷、行動(dòng)活潑的雌成螨，將其背部粘在載玻片一端的雙面膠帶上（保證螨足、螨須和口器可自由活動(dòng)），每片粘30頭。在溫度（25±1）℃、濕度60%～80%、L∥D=14 h∥10 h條件下飼養(yǎng)，及時(shí)加水保濕，4 h后用雙目鏡觀(guān)察，剔除死亡或不活潑個(gè)體。將帶螨玻片的一端浸入藥液中，輕輕搖動(dòng)5 s后取出，用吸水紙迅速吸干螨體及其周?chē)嘤嗟乃幰?，每個(gè)濃度重復(fù)3次。處理后將試螨置于上述條件的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用雙目鏡調(diào)查死亡數(shù)，計(jì)算死亡率、校正死亡率及相對(duì)毒力。計(jì)算公式及分析方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

化合物2，無(wú)色針狀晶體，經(jīng)改良碘化鉍鉀溶液后顯色，表明該化合物可能為生物堿類(lèi)。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.31～7.40（5H，m，Ar-H），5.04（1H，t，H-3），4.19（1H，m，H-11α），3.79（1H，m，H-11β），3.38（1H，d，J=4.8 Hz，H-5），3.13（1H，m，H-1），3.11（1H，m，H-7），2.46（3H，s，NCH3），2.17（2H，m，H-4α），2.00～2.07（1H，m，H-6），2.05（1H，m，H-2α），1.60（1H，d，J=15.2 Hz，H-4β），1.36（1H，d，J=15.6 Hz，H-2β）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：174.2（C-9），136.7（C-12），128.4（2C，C-14，C-16），128.1（2C，C-13，C-17），126.59（C-15），82.1（C-10），69.5（C-11），68.0（C-3），59.7（2C，C-1，C-5），55.2（C-6），54.6（C-7），33.3（C-8），29.7（C-4），25.9（C-2）.Anal.calcd.for C17H21NO4：C，63.94，H，6.63;N，4.39.Found：C，64.00;H，6.60;N，4.42.ESI-MS m/z：320.35[M+H]+。依據(jù)文獻(xiàn)及譜圖分析結(jié)果，確定化合物2為樟柳堿[21]。

化合物4，無(wú)色針狀晶體，經(jīng)改良碘化鉍鉀溶液后顯色，表明該化合物可能為生物堿類(lèi)。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.32～7.43（5H，m，Ar-H），4.99（1H，m，H-3），4.26（1H，m，H-6），4.18（1H，m，H-10），3.85（2H，m，H11α），3.37（1H，m，H-1），3.11（1H，d，J=2.4 Hz，H-5），2.46（3H，s，NCH3），2.29（1H，m，H-4α），2.07（1H，m，H-2α），1.70（1H，d，J=16.0 Hz，H-4β），1.53（1H，m，H-2β）.13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：175.3（C-9），137.6（C-12），131.6（2C，C-14，C-16），130.6（2C，C-13，C-17），129.5（C-15），72.6（C-6），71.6（C-5），67.5（C-3），64.4（2C，C-1，C-11），56.0（C-10），42.7（C-8），36.8（C-7），36.5（C-2），35.2（C-4）;Anal.calcd.for C17H23NO4：C，66.86;H，7.59;N，4.59.Found：C，67.00;H，7.55;N，4.62.ESI-MS m/z：306.24[M+H]+。依據(jù)文獻(xiàn)及譜圖分析結(jié)果，確定化合物4為山莨菪堿[22]。

2.2 殺蚜殺螨活性測(cè)定結(jié)果

毒力測(cè)定結(jié)果（表1）表明，樟柳堿對(duì)豆蚜、棉蚜、麥長(zhǎng)管蚜具有較強(qiáng)的觸殺活性，其LC50依次為0.495、0.429、0.881 mg/mL，其活性稍高于魚(yú)藤酮或與其相當(dāng)（0.617、0.436、1.030 mg/mL），相對(duì)毒力分別為魚(yú)藤酮的1.246、1.017、1.168倍。樟柳堿對(duì)甘藍(lán)蚜、禾谷縊管蚜和桃蚜的觸殺活性不及魚(yú)藤酮。山莨菪堿對(duì)棉蚜的觸殺活性（0.404 mg/mL）與魚(yú)藤酮相當(dāng)，相對(duì)毒力為魚(yú)藤酮的1.078倍，對(duì)甘藍(lán)蚜、禾谷縊管蚜、桃蚜、豆蚜和麥長(zhǎng)管蚜的觸殺活性低于魚(yú)藤酮。

毒力測(cè)定結(jié)果表明（表2），樟柳堿對(duì)朱砂葉螨、二斑葉螨具有較強(qiáng)的觸殺活性，LC50為0.484、0.446 mg/mL，其活性稍高于魚(yú)藤酮，相對(duì)毒力為魚(yú)藤酮的1.136、1.154倍。山莨菪堿對(duì)朱砂葉螨、二斑葉螨的觸殺活性（0.331、0.430 mg/mL）高于魚(yú)藤酮，相對(duì)毒力分別為魚(yú)藤酮的1.662、1.198倍。2種生物堿對(duì)截形葉螨和山楂葉螨的毒力均低于魚(yú)藤酮。

3 結(jié)論與討論

本研究借鑒項(xiàng)目組前期從唐古特莨菪中分離獲得2種生物堿化合物（莨菪堿和東莨菪堿）并發(fā)現(xiàn)其具較強(qiáng)殺蚜殺螨活性的思路及方法，繼續(xù)分離并表征了2種生物堿結(jié)構(gòu)，分別為山莨菪堿和樟柳堿。以同樣來(lái)源于植物（豆科Leguminosae魚(yú)藤屬Derris等植物）的魚(yú)藤酮為藥劑對(duì)照，通過(guò)測(cè)定2種生物堿對(duì)甘藍(lán)蚜等6種蚜蟲(chóng)和朱砂葉螨等4種葉螨的觸殺活性，發(fā)現(xiàn)樟柳堿對(duì)豆蚜、棉蚜、麥長(zhǎng)管蚜以及朱砂葉螨和二斑葉螨具有較強(qiáng)的觸殺活性，LC50在0.429～0.881 mg/L之間;山莨菪堿對(duì)棉蚜以及朱砂葉螨和二斑葉螨也具有較強(qiáng)的觸殺活性，LC50在0.331～0.430 mg/L之間，2種生物堿對(duì)供試蚜蟲(chóng)和葉螨的活性均稍高于對(duì)照藥劑魚(yú)藤酮或與其相當(dāng)。

莨菪烷類(lèi)生物堿是含莨菪烷骨架且生理活性很強(qiáng)的一類(lèi)天然產(chǎn)物化合物，人工合成之衍生物數(shù)量也較多，但有關(guān)其活性的研究偏重于醫(yī)藥、植物化學(xué)等領(lǐng)域[13，23]。關(guān)于莨菪烷類(lèi)生物堿的農(nóng)藥活性，作者報(bào)道過(guò)莨菪堿、東莨菪堿的殺蚜殺螨活性[17]，結(jié)合本文對(duì)山莨菪堿和樟柳堿的殺蚜殺螨活性研究結(jié)果，總體認(rèn)為這4種生物堿具有較強(qiáng)的殺蚜殺螨活性，且對(duì)有些蚜蟲(chóng)和葉螨的活性高于魚(yú)藤酮，為利用莨菪烷類(lèi)生物堿創(chuàng)制新農(nóng)藥提供了線(xiàn)索和新思路。但其在農(nóng)藥上的應(yīng)用可能會(huì)因原料來(lái)源而受到限制，其化學(xué)合成在經(jīng)濟(jì)上可行性不強(qiáng)，因此這些化合物在農(nóng)藥上能否商業(yè)化很大程度上還取決于它們?cè)谇芽浦参镏械暮考胺蛛x程度。今后的研究方向是：1）開(kāi)展三維定量構(gòu)效關(guān)系研究指導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和衍生合成，通過(guò)農(nóng)藥生物活性測(cè)定篩選出高活性化合物，結(jié)合高活性化合物的作用機(jī)理研究，為創(chuàng)制新農(nóng)藥提供技術(shù)支撐和理論依據(jù);2）用生物反應(yīng)器替代植物自身生產(chǎn)系統(tǒng)，即擴(kuò)增、克隆莨菪烷生物堿生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵性基因序列，導(dǎo)入替代生物反應(yīng)器，甚至通過(guò)基因過(guò)表達(dá)來(lái)指導(dǎo)生物堿的高效生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）