大蒜秸稈可溶性膳食纖維的超聲復合酶解提取及其抗氧化性分析

趙勻淑 程靜 盧子博 李璇 陳文文 黃六容

摘要：為了增強大蒜秸稈膳食纖維的生理功能，研究了不同提取方法對其可溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）含量的影響。以SDF含量為響應(yīng)值，對比分析超聲、酶解及超聲復合酶解法的改性效果，研究固液比、超聲時間、超聲功率、加酶量和酶解時間等因素對SDF得率的影響，通過羥基（·OH）和1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）清除率評價SDF的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，超聲復合酶解法提取的SDF得率最高，通過單因素優(yōu)化試驗確定其最佳提取條件為固液比1∶30、超聲功率300 W、超聲時間15? min、加酶量5%、酶解時間4 h;SDF對·OH和DPPH·的清除率較強，其IC50（50% Inhibitory concentration，IC50）分別為1.41和0.64 mg/mL，且在一定濃度范圍內(nèi)，自由基清除率與SDF濃度呈現(xiàn)劑量效應(yīng)線性關(guān)系，說明大蒜秸稈SDF是一種較好的抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：大蒜秸稈;可溶性膳食纖維;超聲;酶解

中圖分類號：TS201.2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）06-0117-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.06.027? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to enhance the physiological function of garlic straw dietary fiber，the different extraction methods on the soluble dietary fiber （Soluble dietary fiber，SDF） content were studied. Taking SDF content as the response value，the modification effects of ultrasound，enzymatic hydrolysis and ultrasonic complex enzymatic hydrolysis were compared and analyzed，and the effects of solid-liquid ratio，ultrasound time，ultrasound power，enzyme amount and enzymatic hydrolysis time on the yield of SDF were studied. The antioxidant capacity of SDF in vitro was evaluated by the clearance rate of hydroxyl（·OH） and 1，1-diphenyl-2-amylhydrazine free radicals （DPPH·）. The results suggested that when garlic straw was pretreated by ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis method，the SDF yield was the highest. The optimal extraction conditions consisted of solid/liquid ratio of 1∶30， ultrasonic power of 300 W，ultrasonic time of 15 min，E/S ration of 5% and enzymatic hydrolysis of 4 h. The IC50 of SDF on OH· and DPPH· were obtained to be 1.41 and 0.64 mg/mL， respectively. Moreover，the relationship between free radical scavenging rate and SDF concentration was linear， suggesting that SDF was a good antioxidant.

Key words： garlic straw; soluble dietary fiber; ultrasound; enzymatic hydrolysis

膳食纖維根據(jù)溶解性的不同可分為不溶性膳食纖維（Insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）兩大類[1]。可溶性膳食纖維由于含有大量的親水基團，它不但具有顯著生理功能，還可以提高食品的持水性、持油性以及冷凍穩(wěn)定性，常作為營養(yǎng)添加劑和食品改良劑廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)應(yīng)用中[2-4]。大蒜秸稈中可溶性膳食纖維含量較低，不符合高品質(zhì)膳食纖維的要求，為了提高其應(yīng)用價值，找到合適的方法改善膳食纖維的溶解性具有重要的意義。

超聲波是一種頻率大于20 kHz的機械振動，在常溫常壓下能產(chǎn)生機械作用、熱作用、空化作用和化學作用，可改變分子間作用力及分子結(jié)構(gòu)[5]。纖維素酶作用于膳食纖維可使不溶性膳食纖維的部分成分發(fā)生降解生成溶解性的小分子膳食纖維，而且酶法制得的膳食纖維色澤淺，易漂白，無異味，純度較高。將超聲和酶解技術(shù)結(jié)合可以大大提高酶的活性、縮短酶解時間、降低酶的用量，使部分不溶性成分轉(zhuǎn)變成可溶性成分[6-8]。本研究的目的是深入研究超聲復合酶法對大蒜秸稈中SDF含量的影響，并分析所提取SDF的體外抗氧化能力，以找到一種合適的提高膳食纖維溶解性的高效、綠色環(huán)保技術(shù)方案。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與材料

可見分光光度計Unic7200，尤尼柯（上海）儀器有限公司;離心機DL-5C，上海安亭儀器廠;超聲細胞破碎機GA99-ⅡD，無錫上佳生物技術(shù)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀BUCHI/R210，瑞士BUCHI實驗室技術(shù)服務(wù)有限公司。

大蒜秸稈由金鄉(xiāng)成功生物科技有限公司提供;纖維素酶（20 000 U/g），上海金穗生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH），Sigma公司;水楊酸，洛陽化學試劑廠;其他均為國藥集團化學試劑有限公司試劑。

1.2? 方法

1.2.1? 原料的預(yù)處理? 大蒜秸稈于大蒜鱗莖收割后采收，于陽光下曬干，剪為1～2 cm段后50 ℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩。

1.2.2? 大蒜秸稈SDF的制備工藝? 稱取秸稈粉碎物6 g，按不同固液比加入去離子水，初始溫度20 ℃、超聲處理一定時間，工作/間歇比為2 s/2 s，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH為6.0并加入纖維素酶，50 ℃恒溫酶解不同時間，100 ℃滅酶15 min，5 000 r/min離心15 min得上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮上清液，4倍體積95%的乙醇沉淀12 h，5 000 r/min離心10 min，得沉淀，用78%乙醇、95%乙醇、丙酮各洗滌1次，60 ℃烘干即為SDF，根據(jù)式（1）計算SDF得率：

1.2.3? 大蒜秸稈SDF的提取方法

超聲處理：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合后，于500 W超聲處理10 min。

酶解處理：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合后，利用3%（Enzyme/Substrate，E/S ratio）纖維素酶酶解3 h。

超聲復合酶解：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合后，于500 W超聲處理10 min，再利用3%（E/S）纖維素酶酶解3 h。

同樣與去離子水進行混合、離心等處理，未進行超聲和酶解的樣品作為對照。

1.2.4? 超聲處理優(yōu)化試驗? 固液比：秸稈粉與去離子水分別按固液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60混合，在超聲功率500 W處理10 min，纖維素酶加入量為5%（Enzyme/Substrate，E/S ratio），50 ℃恒溫酶解3 h。

超聲功率：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合，在超聲功率300、400、500、600和700 W分別處理10 min，纖維素酶加入量為5%，50 ℃恒溫酶解3 h。

超聲時間：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合，在超聲功率300 W分別處理5、10、15、20和25 min，纖維素酶加入量為5%，50 ℃恒溫酶解3 h。

1.2.5? 酶解處理優(yōu)化試驗? 加酶量：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合，在超聲功率300 W預(yù)處理15 min，纖維素酶加入量為1%、3%、5%、7%、9%，50 ℃恒溫酶解3 h。

酶解時間：秸稈粉與去離子水按固液比1∶30混合，在超聲功率300 W預(yù)處理15 min，纖維素酶加入量為5%，50 ℃恒溫酶解1、2、3、4、5 h。

1.2.6? 羥自由基（·OH）清除率的測定? 取2 mL樣品稀釋液依次加入2 mL 3 mmol/L的FeSO4、2 mL 3 mmol/L的H2O2，混勻后25 ℃反應(yīng)10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸，混勻靜置15 min，混合物于4 500 r/min離心10 min，上清液在510 nm處測其吸光度記為Aa;當用去離子水代替水楊酸時的吸光度記為Ab;以去離子水代替稀釋液的吸光度記為A0。維生素C作為陽性對照，以式（2）計算·OH清除率[9]：

·OH清除率=[1-（Aa-Ab）/A0]×100%? ?（2）

式中，A0為不加樣品的對照值;Aa為加樣品的測定值;Ab為樣品在體系中的吸光度。

1.2.7? DPPH·清除率的測定? 取3 mL樣品稀釋液，加入1 mL DPPH·溶液，25 ℃反應(yīng)20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在517 nm處測其吸光度為Ai;另取3 mL稀釋液于試管中，加入無水乙醇1 mL，反應(yīng)20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在517 nm處測其吸光度為Aj;以1 mL DPPH·溶液和3 mL無水乙醇相同條件下反應(yīng)，其吸光度記為A0。維生素C作為陽性對照，以式（3）計算DPPH·清除率[10]：

DPPH·清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%? ?（3）

式中，A0為不加樣品的對照值;Ai為加樣品的測定值;Aj為樣品在體系中的吸光度。

1.2.8? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析? 所有試驗進行3次重復測定，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差（x±s）的形式表示，采用Excel 2010統(tǒng)計分析和作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同提取方法對SDF得率的影響

分別采用超聲法、酶解法及超聲復合酶解法提取大蒜秸稈的SDF，不同作用對SDF得率的影響見圖1。由圖1可知，超聲單獨作用對SDF得率的影響較小，纖維素酶單獨作用時，SDF得率明顯增大，而利用超聲復合纖維素酶處理時，SDF得率大大提高，相對于對照，提高了29.4%。這說明在酶解之前先進行超聲預(yù)處理有助于提高酶解效率，這是因為超聲作用改變了秸稈纖維的組織結(jié)構(gòu)，使其變得更加疏松，從而有助于纖維素酶的酶解，這與Cheng等[11]的研究結(jié)果基本一致。