歐李優(yōu)系組培快繁技術(shù)研究

梁偉玲 陳翠果 孟繁祎 趙敏 孫華冉 劉艷芬

摘要：為建立歐李（Cerasus humilis）優(yōu)系離體快繁技術(shù)體系，對其離體培養(yǎng)過程中初代培養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)3個階段的培養(yǎng)條件進行了研究。結(jié)果表明，以其半木質(zhì)化莖段為外植體，最適初代培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+300 mg/L水解乳蛋白，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。

關(guān)鍵詞：歐李（Cerasus humilis）;組織培養(yǎng);快速繁殖

中圖分類號：S662.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）06-0136-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.06.031? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to establish the technical system of in vitro and rapid propagation of Cerasus humilis，the culture conditions of the first generation culture， the proliferation culture and the rooting culture were studied. The semi-lignified stem segments were used as explants. The results showed that the optimum medium of the first generation medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，the optimum proliferation medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+300 mg/L LH， and the optimum proliferation medium was 1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA.

Key words： Cerasus humilis; in vitro culture; rapid propagation

歐李（Cerasus humilis）又名鈣果，屬薔薇科櫻屬，是中國特產(chǎn)的落葉小灌木。栽培品種果實含有豐富的活性鈣元素，具有多種保健功能[1]。歐李抗寒、耐旱、耐貧瘠，是集營養(yǎng)、保健、綠化、美化于一身的多功能樹種，具有廣闊的市場前景[2]。通過組織培養(yǎng)進行離體快繁是繁殖歐李優(yōu)良苗木的有效方法[3]。已有科研工作者對歐李的組織培養(yǎng)技術(shù)進行了研究[4-7]，但歐李種質(zhì)資源變異類型多[8]，離體培養(yǎng)條件與品種、品系有一定關(guān)系[9，10]，通過離體快繁進行規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)體系尚未成熟。本研究以河北工程大學試驗基地引自河北涉縣的歐李優(yōu)系為材料，通過初代培養(yǎng)，增殖繼代培養(yǎng)，生根與移栽3個階段的培養(yǎng)，確定了其完整的離體快繁體系，旨在為歐李規(guī)?；缣峁┘夹g(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料? 試驗材料為河北工程大學實習基地引自河北涉縣山地的歐李優(yōu)系植株，2015年至2016年以莖段為外植體，進行初代培養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)3個階段的試驗研究。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 初代培養(yǎng)? 以歐李半木質(zhì)化莖段（距梢端第二個至第五個芽）為外植體，經(jīng)過常規(guī)消毒后，剪切成單芽莖段，接種于各處理培養(yǎng)基，每瓶接種3～4個莖段。4周后統(tǒng)計各莖段腋芽的萌發(fā)情況與芽生長狀況。處理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA;處理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA;處理3，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA;處理4：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA。

1.2.2? 增殖繼代培養(yǎng)

1）增殖培養(yǎng)基的選擇。將初代培養(yǎng)的不定芽繼代2次后，形成不定芽叢。將不定芽叢剪成含3～4個不定芽的小芽叢，轉(zhuǎn)接到MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、KT和IBA組合的繼代培養(yǎng)基上。每瓶轉(zhuǎn)接不定芽叢4～5個，每處理接種10～12瓶，3次重復。4周后觀察、統(tǒng)計各處理培養(yǎng)基試管苗的平均增殖率和生長狀況。處理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA;處理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA;處理3，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA;處理4，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA;處理5，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA;處理6，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.10 mg/L IBA。

2）附加成分的篩選。增殖期間，為了保證試管苗良好生長，培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的附加物，不添加為對照。每處理接種12～22瓶。4周后觀察、統(tǒng)計各處理試管苗的平均增殖率和生長狀況。基本培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA，處理1在基本培養(yǎng)基中加入100 mg/L水解乳蛋白，處理2在基本培養(yǎng)基中加入300 mg/L水解乳蛋白，處理3在基本培養(yǎng)基中加入50 mg/L馬鈴薯汁，處理4在基本培養(yǎng)基中加入100 mg/L馬鈴薯汁，處理5在基本培養(yǎng)基中加入2 mg/L AgNO3，處理6在基本培養(yǎng)基中加入5 mg/L AgNO3。

1.2.3? 生根培養(yǎng)? 當試管苗增殖到一定程度時，將不定芽叢剪成2～4 cm單芽（無根嫩枝），接入含有不同濃度和種類生長調(diào)節(jié)劑的生根培養(yǎng)基上，21 d后統(tǒng)計根系發(fā)生率和根系生長狀況。處理1，1/2MS+0.2 mg/L IBA;處理2，1/2MS+0.5 mg/L IBA;處理3，1/2MS+0.5 mg/L IAA;處理4：1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。若無特殊說明，各培養(yǎng)階段每處理的培養(yǎng)基中均含30 g/L蔗糖，5.5 g/L瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)溫度（23±2） ℃，培養(yǎng)室光照度3 000 lx。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 生長調(diào)節(jié)劑對歐李莖段初代培養(yǎng)的影響

將表面滅菌的歐李莖段接入不同的初代培養(yǎng)基，1～2周左右腋芽開始萌動（圖1），4周后的萌芽和生長狀況見表1。從生長情況來看，雖然在較高濃度1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上不定芽發(fā)生數(shù)量多，但是形成的不定芽有玻璃化發(fā)生。在較低濃度0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上不定芽發(fā)生數(shù)量較少，但是不定芽生長良好。因此，選擇最適的初代培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA。

2.2? 增殖培養(yǎng)條件的確定

2.2.1? 生長調(diào)節(jié)劑對歐李試管苗增殖的影響? 歐李試管苗在含有不同濃度生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上，生長狀況與增殖率有明顯不同（表2）。由表2可以看出， 處理1和處理2不定芽發(fā)生數(shù)量少，增殖率低。隨著6-BA和IBA濃度的提高，增殖率有顯著提高，但試管苗生長細弱，個別開始出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象（圖2）。在保證試管苗增殖率的同時保證其健壯生長，選擇處理5，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA，作為歐李試管苗增殖期間最適的生長調(diào)節(jié)劑組合，增殖率可達5.3（圖3）。

2.2.2? 附加物對歐李試管苗增殖的影響? 在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA培養(yǎng)基中，添加不同種類和濃度的附加物，歐李試管苗的生長、增殖狀況見表3。從表3可以看出，添加AgNO3培養(yǎng)基的試管苗莖尖、葉尖壞死狀況均沒有明顯改善。在添加馬鈴薯汁的培養(yǎng)基中，試管苗莖尖變褐壞死狀況略有減輕，但葉片明顯變成黃綠色。添加水解乳蛋白的試管苗增殖率均比對照有所提高，同時莖尖及葉尖壞死現(xiàn)象明顯減少，增殖率可達5.6。因此，最合適的添加物種類及濃度為水解乳蛋白300 mg/L。

2.3? 不同培養(yǎng)基對試管苗生根的影響

歐李試管苗在含有不同種類和濃度生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d，生根情況見圖4和表4。結(jié)果表明，單獨添加IBA和IAA的生根效果均不理想，添加IAA與IBA組合的生根效果較好，生根率高，根系數(shù)量多。

3? 小結(jié)與討論

3.1? 小結(jié)

歐李最適初代培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA，最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+300 mg/L水解乳蛋白，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。

3.2? 討論

以歐李優(yōu)系春季萌發(fā)的半木質(zhì)化莖段為外植體進行了初代培養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)，建立了離體再生體系，實現(xiàn)了離體快繁。在初代培養(yǎng)階段，雖然在不同初代培養(yǎng)基上，莖段有較高的腋芽萌發(fā)率，但是相對幼嫩的莖段（距梢端第2～3個芽），其腋芽萌發(fā)形成的枝條有玻璃化的趨勢。相對老的莖段（距梢端第5～6個芽），腋芽萌發(fā)形成的枝條較充實，但污染率相對較高。因此，外植體的選擇為頂芽以下4～5個節(jié)位的半木質(zhì)化莖段。這與張秀麗[5]的報道頂芽以下4～8個節(jié)位上的腋芽最適合作外植體略有不同。初代培養(yǎng)過程中，4—5月取材時未發(fā)現(xiàn)外植體有褐化現(xiàn)象，這與黃立華等[11]在研究歐李取材時期及取材部位時，外植體有褐化的報道也有不同。這可能由于歐李品系不同，枝條的生長特性有差異，枝條及其不同節(jié)位的芽充實程度也不同。

在歐李試管苗增殖培養(yǎng)期間，6-BA與KT配合使用優(yōu)于6-BA單獨使用的效果，既能保證較高的增殖率，也能保證試管苗的正常生長，這與莊麗娟等[4]的報道一致。隨著繼代次數(shù)的增多，歐李試管苗出現(xiàn)了莖尖、葉尖壞死、玻璃化等現(xiàn)象。添加物合適濃度的水解乳蛋白有一定的緩解作用。同時，培養(yǎng)基中將蔗糖濃度由30 g/L提高到35 g/L時，玻璃化有減輕的趨勢[12，13]。試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，增殖繼代2年以上的試管苗，試管苗的生長勢逐漸減弱，增殖率有所降低，其機理有待進一步研究。

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