文心蘭切花無(wú)病毒種苗組培快繁生產(chǎn)技術(shù)

韓松　王安石　陳施明　周慧　林明光

摘要：針對(duì)目前文心蘭工廠化育苗過(guò)程中種苗帶病毒比率偏高的突出問(wèn)題，筆者于近幾年開展了文心蘭切花無(wú)病毒種苗組培快繁生產(chǎn)技術(shù)研究，在取得一定成功經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上總結(jié)了一套文心蘭無(wú)病毒健康種苗工廠化生產(chǎn)的技術(shù)體系及其流程，為該切花健康種苗的組培快繁生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：文心蘭 切花 無(wú)病毒種苗 組織培養(yǎng) 快速繁殖

文心蘭是文心蘭屬（Oncidium）植物總稱，目前世界栽培的文心蘭切花品種不多，南茜及其變異品種仍為文心蘭主栽品種。由于品種間雜交不育和自交不親和，生產(chǎn)上所需的種苗主要通過(guò)組培快繁技術(shù)。組織培養(yǎng)技術(shù)在克隆親本植物性狀同時(shí)，也復(fù)制其親本單株所感染的病毒病。病毒病是文心蘭生產(chǎn)上重要病害，國(guó)內(nèi)為害文心蘭的病毒主要是建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒，為系統(tǒng)性感染，使蘭株生長(zhǎng)緩慢，葉片出現(xiàn)條紋、斑塊、壞疽或綠色分布不均的嵌紋病斑：花朵上也會(huì)出現(xiàn)色澤不均、畸形、或提早凋萎等病斑，嚴(yán)重影響植株生長(zhǎng)勢(shì)、切花產(chǎn)量與品質(zhì)，且這2種病毒通常在文心蘭上復(fù)合感染，造成更為嚴(yán)重的為害。文心蘭感染病毒初期并不表現(xiàn)明顯病癥，容易導(dǎo)致栽培者的疏忽，帶病毒的種苗在生產(chǎn)上使用極為普遍。據(jù)筆者于2014年對(duì)海南省各地文心蘭種植園采集的299個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其蘭株總帶毒率為28.1%，其中，攜帶建蘭花葉病毒率為13.7%，攜帶齒唇蘭環(huán)斑病毒率為17.1%，同時(shí)攜帶2種病毒的攜帶率為2.3%。種苗帶病毒嚴(yán)重影響后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育、開花品質(zhì)和鮮切花產(chǎn)量。為解決文心蘭工廠化育苗過(guò)程中種苗帶病毒比率偏高的突出問(wèn)題，筆者從2012年起開展了文心蘭切花無(wú)病毒種苗組培快繁生產(chǎn)技術(shù)的研究，并于2014年底生產(chǎn)出首批無(wú)病毒健康種苗在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

1.建立無(wú)病健康種苗快繁技術(shù)體系

1.1無(wú)病健康種苗驗(yàn)證制度重要性

世界首次無(wú)病健康種苗驗(yàn)證制度源自于1929年荷蘭輸往美國(guó)的郁金香種球，被美方以攜帶為害性病毒病被拒絕入境。20世紀(jì)30年代，荷蘭掌據(jù)了病毒檢測(cè)技術(shù)后，生產(chǎn)出健康無(wú)病毒種球作用繁殖用種源，由此，荷蘭政府推動(dòng)郁金香種球品質(zhì)驗(yàn)證制度，真正全面增強(qiáng)其郁金香種球競(jìng)爭(zhēng)力，使其成為全球第一大郁金香輸出國(guó)。文心蘭切花是臺(tái)灣省最大宗出口鮮切花品種，全省種植面積約200hm2，臺(tái)灣農(nóng)委防檢局于2002年3月12日公告實(shí)施文心蘭無(wú)病毒種苗驗(yàn)證制度，讓符合標(biāo)準(zhǔn)的種苗獲得官方驗(yàn)證，提升了其品質(zhì)與競(jìng)爭(zhēng)力。應(yīng)用健康種苗防治系統(tǒng)性病害，因其增產(chǎn)增收增效作用明顯已在生產(chǎn)上逐漸應(yīng)用，我國(guó)健康種苗驗(yàn)證制度目前仍以鼓勵(lì)性質(zhì)，尚未立法全面強(qiáng)制執(zhí)行，在文心蘭切花生產(chǎn)中宜效仿臺(tái)灣文心蘭驗(yàn)證制度，著手建立適合我國(guó)產(chǎn)業(yè)需求的種苗驗(yàn)證制度。

1.2無(wú)病健康種苗快繁的關(guān)鍵技術(shù)

無(wú)病毒種苗是未被病毒感染，或經(jīng)人工處理去除病毒的植物苗株，病毒病是文心蘭栽培的重要病害，主要通過(guò)帶病種苗傳染，為了保證在文心蘭切花生產(chǎn)中應(yīng)用無(wú)病毒苗株，需要建立主栽品種的無(wú)病毒母本園，由它提供親本外植體繁殖材料。并掌握快速、專一和敏感的病毒檢測(cè)方法，能快速高度專一地檢出存在微量的病原，在短時(shí)間內(nèi)處理多個(gè)樣品，檢測(cè)多種病毒，且節(jié)約成本。健康種苗應(yīng)用中，種苗生產(chǎn)速率必須高于栽培后病毒再感染速率，才能取代田間已感病植株，降低田間病原密度，達(dá)到延緩病害流行效果，因此種苗能否大量快速生產(chǎn)也是健康種苗應(yīng)用能否成功關(guān)鍵。以文心蘭花梗芽作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)增殖可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速繁殖的目的。通常1株生長(zhǎng)旺盛的文心蘭植株每年可萌生3～6支花梗，每支花梗平均有5個(gè)芽，可用于誘導(dǎo)的外植體有15～30個(gè)，切除花梗，母株生長(zhǎng)不受影響，且外植體采摘和消毒方便。因此，花梗芽組培快繁技術(shù)對(duì)無(wú)病毒優(yōu)良種苗快繁作用非常重要。

此外，必須完全掌握病毒傳播途徑及可能污染源傳播方式。為害文心蘭鮮切花生產(chǎn)的2種重要病毒CyMV和ORSV經(jīng)由機(jī)械性傷口入侵植物體內(nèi)，因其在細(xì)胞外可存活極長(zhǎng)時(shí)間，甚至長(zhǎng)達(dá)10年之久，為穩(wěn)定性極高的傳性病毒，容易污染栽培環(huán)境、器具與人員，組織培養(yǎng)或田間栽培管理過(guò)程中，所有可能造成表面?zhèn)诘牟僮?，包括接種、換盆、修剪、切花甚至植株葉片間摩擦，都可能是病毒入侵感染的途徑。在無(wú)病毒健康種苗繁殖過(guò)程，確保繁殖后代種苗不會(huì)再次受到病原感染，以確保健康種苗品質(zhì)。同時(shí)在無(wú)病健康種苗應(yīng)用到田間時(shí)，采取預(yù)防病毒傳染的栽培措施，延緩或避免健康種苗受病毒感染，充分發(fā)揮健康種苗作用。

1.3無(wú)病健康種苗組培快繁技術(shù)流程

無(wú)病健康種苗組培快繁技術(shù)體系包括無(wú)病毒母本園建立，病毒檢測(cè)技術(shù)和組培快繁技術(shù)3個(gè)部分，通過(guò)選擇優(yōu)良性狀的親本蘭株，經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè)程序，測(cè)定無(wú)病毒感染后，進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁，生產(chǎn)大量組培分生苗。無(wú)病毒健康種苗繁殖流程詳見(jiàn)圖1。

2.無(wú)病毒母本園建立

2.1母本園的設(shè)施條件

母本園栽培種植適宜在具有遮雨、防蟲（防蟲網(wǎng)為100目）、移動(dòng)式遮陽(yáng)網(wǎng)和水簾風(fēng)機(jī)或空調(diào)調(diào)節(jié)適合植株生長(zhǎng)的隔離環(huán)境中。文心蘭最適宜生長(zhǎng)的溫度為25～30℃。一般只能接受冬季的陽(yáng)光直射，夏季遮光60%～70%，其他季節(jié)遮光40%。

2.2無(wú)病毒繁殖母株的保存

無(wú)病毒繁殖母株是從大田采集優(yōu)良性狀或變異單株，經(jīng)檢測(cè)確定不帶有CyMV和ORSV 2種病毒后作為繁殖母株進(jìn)行保存。母本園內(nèi)的所有無(wú)病毒繁殖母株應(yīng)獨(dú)立編號(hào)，植株間不得相互接觸。若有特殊情況必須將未經(jīng)病毒檢定之植株移入母本園，須單獨(dú)編號(hào)且不得與其他植株接觸，應(yīng)盡速進(jìn)行病毒檢測(cè)，無(wú)病毒感染者方準(zhǔn)予長(zhǎng)期留置母本園內(nèi)保存。栽培期間若發(fā)現(xiàn)可疑植株應(yīng)立即進(jìn)行病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如確定為病毒感染者應(yīng)立即將植株移出保存園，且原置放位置應(yīng)進(jìn)行消毒預(yù)防措施，方能再放置其他母株。移出過(guò)程中需絕對(duì)避免碰觸其他植株，最好以報(bào)紙包裹后再移動(dòng)之。每半年進(jìn)行1次例行母株病毒檢定，以掌握確實(shí)感染狀態(tài)。

2.3母本園的管理措施

母本園應(yīng)嚴(yán)格管控人員出入，并嚴(yán)禁任何人為接觸植株造成感染機(jī)會(huì)。人員在對(duì)母株進(jìn)行操作時(shí)，使用的工具應(yīng)經(jīng)消毒處理，單株單剪，隨株更換，不得重復(fù)使用。若有碰觸植株時(shí)，應(yīng)配戴抽換式手套，且必須隨植株更換。母本園內(nèi)應(yīng)隨時(shí)保持整潔，植株殘?bào)w必須隨時(shí)清除，不得隨意遺棄。所使用盆缽、介質(zhì)、器具及花梗固定用器材等應(yīng)采用全新資材。應(yīng)設(shè)置管理紀(jì)錄簿，仔細(xì)記錄母本編號(hào)、移入日期、存放位置及病蟲害防治措施等。

2.4母本園的消毒措施

場(chǎng)地及表面消毒以0.5%漂白水定期噴濕表面擦拭。人體常接觸部位，如門把、電器開關(guān)、澆水噴頭手把、掃帚手把等也應(yīng)定期以0.5%漂白水擦拭。使用器材和工具根據(jù)實(shí)際情況，可參考張清安（1995）的4種消毒方法，擇一采用。一是干熱消毒法，利用烘箱在180℃至少維持1 h；二是濕熱消毒法，以沸水煮沸至少15 min；三是火焰消毒法，將工具上接觸過(guò)植物汁液的部位以火焰燒烤至少10～20 s；四是化學(xué)藥品消毒法，以3%氫氧化納或磷酸三鈉溶液浸漬至少1 min。

3.文心蘭病毒檢測(cè)技術(shù)

3.1采樣方法

取樣數(shù)量為大田栽培植物或組培苗抽取全部有癥狀疑似病株，無(wú)癥狀植株按其總數(shù)的3%～5%隨機(jī)抽樣，最低抽樣50株，不夠50株的全部抽??；組培母瓶抽取全部樣品。取樣部位為疑似病株，取有明顯癥狀葉片，無(wú)癥狀植株，取完全展開的淡綠期葉片。樣品采集時(shí)，用滅菌的手術(shù)剪剪取葉片1片置于封口袋中-20℃保存，最多存放7 d。

3.2繁殖母株的病毒檢測(cè)

從田間收集或引種的具有優(yōu)良性狀的繁殖母株樣品采用雙抗體夾心法（DAS-ELISA）按照劉福秀等（2013）的方法檢測(cè)CymMV和ORSV。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)。讀取405 nm的吸收值，參照Satu1a等（19860的方法，吸收值在陰性對(duì)照的2倍以上視為陽(yáng)性。2種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性的樣品進(jìn)入母本園待用，任一病毒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性均淘汰。此檢測(cè)方法快速、經(jīng)濟(jì)，可準(zhǔn)確檢測(cè)此2種病毒，能在很大程度上保證用于繁殖的母本植株不攜帶病毒。

3.3組培母瓶的病毒檢測(cè)

采用雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)技術(shù)，參照劉福秀等（2014）的方法檢測(cè)組培母瓶的帶毒情況。擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)675 bp條帶視為CymMV陽(yáng)性，出現(xiàn)524 bp條帶視為ORSV陽(yáng)性。2種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性的組培瓶進(jìn)入下一步擴(kuò)繁操作，任一病毒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性均淘汰。該檢測(cè)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)2種病毒，其敏感度約為ELISA的1000倍以上，在陽(yáng)性樣品總RNA稀釋10000倍后仍能檢測(cè)出病毒信號(hào)，且對(duì)部分經(jīng)ELISA測(cè)定為陰性的樣品中仍可順利檢測(cè)到病毒信號(hào)?？杀ＷC生產(chǎn)出來(lái)的種苗不攜帶這2種病毒。

4.花梗芽無(wú)病毒組培快繁技術(shù)

4.1無(wú)病毒組培母瓶培養(yǎng)

組培母瓶培養(yǎng)根據(jù)王安石（2015）研究，以外形呈筍狀，花苞和分叉始露出花梗苞片，高約70cm和中部節(jié)位的花梗上的芽為最適宜外植體；用0.1%升汞消毒處理花梗芽的適宜時(shí)間為12 min；1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2mg/L為花梗芽最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以35～40 d為1個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，經(jīng)1～3次轉(zhuǎn)接后約95%的花梗芽轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)芽，把經(jīng)過(guò)3次誘導(dǎo)所有獲得的營(yíng)養(yǎng)芽，經(jīng)RT-PCR病毒檢測(cè)技術(shù)確認(rèn)無(wú)病毒后，以無(wú)病毒組培母瓶進(jìn)行集中增殖培養(yǎng)。

4.2增殖培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)以6.BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L為最佳激素組合；以溫度25℃和光照強(qiáng)度2500 Lx（光照時(shí)間10-12 h/d）的培養(yǎng)條件最為理想。以繼代培養(yǎng)基為MS+6.BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+椰子水100 mL/L。壯苗培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+香蕉漿50 g/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉漿50 g/L。叢生芽培養(yǎng)以雙芽或三芽為單位個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每45 d為1個(gè)循環(huán)周期繼代轉(zhuǎn)接1次，原球莖培養(yǎng)25～30 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接不超過(guò)12代。株高在3.0 cm以下的小苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)周期為50～60 d。經(jīng)壯苗培養(yǎng)株高達(dá)3.0 cm以上，有5～6片葉的小苗切分成獨(dú)立的植株進(jìn)行生根培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入12 cm×15 cm聚丙烯組培袋，每袋放置10株小苗，轉(zhuǎn)入500 mL玻璃瓶每瓶放置25株。

4.3出圃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)生根培養(yǎng)60 d后，達(dá)到以下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)作為合格組培苗即可出廠：一是植株生長(zhǎng)健壯、挺直，葉片舒展、從基部往上呈互生狀，有層次感，無(wú)玻璃化，無(wú)黃葉；二是培養(yǎng)基及材料無(wú)真菌和細(xì)菌污染；三是苗高8～12 cm，苗粗0.4～0.59 cm，葉片數(shù)7片以上，根5根以上。合格組培苗經(jīng)健化培養(yǎng)240 d的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。