響應(yīng)曲面法優(yōu)化板栗酶解工藝研究

張樂+王趙改+楊慧+王曉敏+史冠瑩

摘 ? ?要：以板栗為原料研究了板栗漿的酶解工藝，通過單因素試驗(yàn)，對(duì)影響板栗酶解工藝的因素酶加量、料液比、溫度、時(shí)間、pH值進(jìn)行研究。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析建立還原糖含量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，確定了影響因素依次為加酶量>溫度>時(shí)間>pH，得到的最佳酶解工藝條件為α-淀粉酶的添加量0.3%，料液比（g∶mL）1∶4，溫度65 ℃，pH值 6.5，酶解時(shí)間60 min，還原糖含量（DE值）可達(dá)14.56%。

關(guān)鍵詞：板栗;酶解;還原糖;響應(yīng)曲面法

中圖分類號(hào)：S664.2 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.012

Optimization of Enzymolysis Technology of Chestnut by Response Surface Methodology

ZHANG Le， WANG Zhao-gai， YANG Hui， WANG Xiao-min， SHI Guan-ying

（Institute of Agricultural Products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou， Henan 450008， China）

Abstract： The enzymolysis technology of chestnut was investigated. The influencing factors of enzymatic hydrolysis technology of chestnut including dosage of enzyme， ratio of solid， temperature， time， pH were studied. Based on the result of the single factor experiment， the quadratic polynomial model of the reducing sugar content by using Box-Behnken design and response surface methodology was designed. Factor contribution rate obtained from the F-test were as follows：dosage of enzyme > temperature > time > pH value. The optimum hydrolytic parameters obtained from response surface analysis were as follows： the dosage of the α-amylase 0.3%， solid-liquid 1∶4， temperature 65 ℃， pH value 6.5， enzymolysis time 60 min. Under the optimized conditions， the actual reducing sugar content（DE value） was 14.56%.

Key words： chestnut;enzymolysis;reducing sugar;response surface methodology

板栗[Castanea mollissima Blume]也稱為栗子、中國(guó)板栗，是殼斗科、栗屬、堅(jiān)果類植物，在中國(guó)已有3 000余年栽培歷史[1]。板栗淀粉含量高達(dá)到70%左右，與糧谷類相當(dāng)，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、B族維生素等多種營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)冠心病、動(dòng)脈硬化等疾病有較好藥用價(jià)值，素有“鐵桿莊稼”“干果之王”的美稱[2-3]。我國(guó)是世界上最大的板栗生產(chǎn)國(guó)，在20多個(gè)省均有栽培，栽培面積111萬hm2，年產(chǎn)量100萬t，占全球產(chǎn)量的70%[4]。由于板栗在貯藏過程中容易出現(xiàn)霉?fàn)€、發(fā)芽、生蟲等問題，不宜久藏。另外我國(guó)板栗多以生栗原料銷售為主，加工量少，加工轉(zhuǎn)化率僅為20%～30%，而發(fā)達(dá)國(guó)家為90%～95%[5]。板栗加工主要集中在初加工如糖炒栗子，深加工產(chǎn)品以板栗罐頭為主，品種較少，科技含量不高，加工技術(shù)比較落后，生產(chǎn)效率低[6]。因此，迫切需要提高板栗產(chǎn)品的精深加工和綜合利用能力，開發(fā)各種優(yōu)質(zhì)的深加工新產(chǎn)品。

板栗果仁中淀粉含量高，使板栗飲料類制品在加工過程中溶解性差，常易產(chǎn)生固液分離，造成飲料分層、沉淀現(xiàn)象，同時(shí)易發(fā)生褐變、香味流失等問題[7]。在板栗漿中加入α-淀粉酶進(jìn)行酶解，可切斷一些枝條使淀粉網(wǎng)囊松開，降低粘稠度;還可將淀粉水解成為低分子的糊精和可溶性糖類，提高其溶解性和甜度;另外由于酶的專一性，這樣僅作用于淀粉類物質(zhì)，可以完整保持板栗的原有風(fēng)味物質(zhì)和香氣成分[8]，從而有效地解決上述問題，對(duì)板栗的深度加工和更高層次的開發(fā)利用有著重要的意義。已有研究報(bào)道采用生物酶解技術(shù)，制備了馬鈴薯等高淀粉含量的固體飲料[9]，這為板栗固體飲料加工提供了一定的借鑒方法。本研究針對(duì)速溶板栗粉生產(chǎn)過程中的酶解工藝這個(gè)難點(diǎn)進(jìn)行重點(diǎn)研究，優(yōu)化板栗漿的酶解工藝條件，以期為板栗制品的后續(xù)制作加工奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

鮮板栗原料品種為大板紅，由河北美可多食品有限公司提供。α-淀粉酶（酶活3 700 U·g-1），購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉等購于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，分析純;重蒸酚購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;JYL-C022E型九陽料理機(jī)，九陽股份有限責(zé)任公司;NUⅡ-10T型實(shí)驗(yàn)室（超）純水機(jī)，南京優(yōu)普—實(shí)驗(yàn)室純水處理系統(tǒng);H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南長(zhǎng)沙湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;genesys10suv紫外分光分光度計(jì)，賽默飛世爾科技; ME204E型萬分天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 板栗酶解工藝 將板栗脫殼、去衣、切片，稱取板栗片按一定料液比打漿，在90 ℃恒溫水浴糊化20 min，調(diào)pH值為酶的適宜值，加酶，一定溫度下酶解一定時(shí)間后，沸水浴滅酶5 min，冷卻后轉(zhuǎn)移至離心管中，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，測(cè)定還原糖含量，表示水解度。以未酶解為對(duì)照CK。

1.3.2 還原糖測(cè)定 采用 3、5-二硝基水楊酸比色法[10]。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。分別吸取1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL刻度試管中，分別加水補(bǔ)至2 mL，再加入1.5 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴中加熱5 min取出，冷卻至室溫，用蒸餾水補(bǔ)至10 mL，混勻，540 nm 波長(zhǎng)下比色測(cè)定。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=1.408 2x 0.096 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

（2）樣液測(cè)定。吸取酶解離心后上清液0.2 mL和1.5 mL DNS顯色劑，加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的濃度及稀釋倍數(shù)，計(jì)算還原糖含量。

1.3.3 酶解工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在其他條件一致時(shí)，改變一個(gè)因素，分別研究酶加量0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%;pH值 5.5，6.0，6.5，7.0， 7.5;酶反應(yīng)時(shí)間20，40，60，80，100 min;酶反應(yīng)溫度50，55，60，65，70 ℃;料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7對(duì)酶解效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定料液比為1∶4，以酶加量、溫度、時(shí)間、pH值為自變量，還原糖含量為響應(yīng)（Y），依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理[11]，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法，建立數(shù)學(xué)模型。自變量因素水平及編碼見表1。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖;通過Design-Expert.8.05b 軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面模型建立和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解效果影響因素研究

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解程度的影響 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解程度的影響結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在反應(yīng)初期，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量增加較快，有顯著差異（P<0.05），到60 min時(shí)達(dá)最大，之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而還原糖含量趨于平穩(wěn)并略有下降。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力得到充分利用，酶解反應(yīng)進(jìn)行的比較完全;而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物的積累抑制了酶的活力。故酶解時(shí)間控制在60 min左右為宜。

2.1.2 pH值對(duì)酶解程度的影響 不同pH值對(duì)酶解程度的影響結(jié)果見圖 2。由圖2以看出，當(dāng)板栗漿pH值在5.0～6.0 時(shí)還原糖含量隨pH值的增大而逐漸增大且差異顯著（P<0.05），pH值為6時(shí)達(dá)最大，之后隨pH值的增大還原糖含量呈下降趨勢(shì)。酶活力受pH值影響較大，在最適pH值下催化反應(yīng)的速率最高，這是因?yàn)閜H 值會(huì)影響底物和酶的構(gòu)象，從而影響酶的活力及其與底物的結(jié)合[12]。

2.1.3 酶加量對(duì)酶解程度的影響 不同酶加量對(duì)酶解程度的影響結(jié)果見圖 3。由圖3可以看出，還原糖含量隨酶加量的增大而逐漸增大，當(dāng)酶加量為0.3%時(shí)達(dá)最大。隨著提取液中酶濃度升高，與底物的接觸面積增大，酶解反應(yīng)速率升高。酶加量低于0.3%時(shí)，底物中的酶未飽和，故還原糖含量在增加。當(dāng)酶濃度達(dá)到過飽和時(shí)，底物濃度相對(duì)較低，酶與底物競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用，故其后增加酶加量時(shí)還原糖含量并未增加。

2.1.4 溫度對(duì)酶解程度的影響 不同溫度對(duì)酶解程度的影響結(jié)果見圖 4。由圖4可知，還原糖含量隨溫度的升高而逐漸增大，65 ℃時(shí)達(dá)最大，之后隨溫度的升高而還原糖含量略有下降。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，溫度升高，酶活性增強(qiáng)、反應(yīng)速度加快，但當(dāng)溫度升高超過酶作用的適宜溫度時(shí)，能使酶活性降低，還原糖含量下降。

2.1.5 料液比對(duì)酶解程度的影響 不同料液比對(duì)酶解程度的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著料液比的升高，還原糖含量逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶4時(shí)還原糖含量達(dá)最大，隨后呈略微下降趨勢(shì)。較低的物料濃度有助于質(zhì)量擴(kuò)散作用的增強(qiáng)，但液料比過大會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，且會(huì)給后續(xù)操作過程帶來負(fù)擔(dān)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶加量、pH值、溫度和時(shí)間作為自變量，以板栗漿酶解后還原糖含量作為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到板栗漿酶解后還原糖含量%（Y）與酶加量（A）、pH值（B）、溫度（C）和時(shí)間（D）4個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型如下：

Y=+14.56+0.37A+0.013B+0.22C-0.084D-1.06AB-0.066AC+0.48AD+0.17BC+0.52BD+0.52CD-2.35A2-1.64B2-2.14C2-1.25D2。

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，該模型的F=22.33，P<0.000 1，表明該模型有意義且達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。決定系數(shù)R2為0.957 1，說明該模型的擬合性較好，可以用此模型對(duì)板栗漿酶解還原糖含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表3還可以看出，A、AB、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)還原糖含量的影響顯著。由F檢驗(yàn)得到因子貢獻(xiàn)率為：A>C>D>B，即酶加量>溫度>時(shí)間>pH值。

2.2.2 單因素效應(yīng)分析 進(jìn)一步分析試驗(yàn)中各因素對(duì)還原糖含量的影響，對(duì)模型進(jìn)行降維處理，即固定任意3個(gè)因素于0水平，得到各因素與還原糖含量的效應(yīng)方程，單因素效應(yīng)曲線如圖6。由圖6可知，各因素對(duì)還原糖含量的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且A（酶加量）變化幅度最大，說明酶加量對(duì)還原糖含量的影響最大。各曲線的變化趨勢(shì)與上文單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合，故說明建立的數(shù)學(xué)模型是合適的。

2.2.3 交互作用分析 方差分析結(jié)果表明， AC、AD、BC、BD無明顯交互作用，AB、CD交互作用顯著，即酶加量與pH值間的交互作用對(duì)還原糖含量有顯著影響;溫度與時(shí)間的交互作用對(duì)還原糖含量有顯著影響。響應(yīng)曲面和等高線如圖7、圖8所示。

從圖7可以看出，當(dāng)酶加量一定，pH值在5.5至6.5范圍內(nèi)，還原糖含量先顯著增大，達(dá)到最大值后又開始慢慢減小;當(dāng)pH值一定時(shí)，酶加量在0.2至0.4之間，還原糖含量先明顯增大，達(dá)到最大之后又開始慢慢減小。由等高線圖形可以看出，橢圓形明顯，二者的交互作用顯著。

從圖8可以看出，當(dāng)溫度一定，時(shí)間在40 min至80 min范圍內(nèi)，還原糖含量先緩慢增大，達(dá)到最大值后又開始慢慢減小;當(dāng)時(shí)間一定時(shí)，溫度在60 ℃至70 ℃之間，還原糖含量先明顯增大，達(dá)到最大之后明顯減小。由等高線圖形可以看出，橢圓形明顯，二者的交互作用顯著。

2.2.4 回歸模型驗(yàn)證 由 Design-Expert.8.0.5b軟件對(duì)模型進(jìn)行典型性分析結(jié)果表明，最佳酶解工藝條件為：酶加量0.31%、pH值 5.99、溫度65.24 ℃、時(shí)間59.75 min，還原糖含量的理論值為14.58%。根據(jù)實(shí)際操作的容易程度，把條件修正為酶加量0.3%、pH 值6.00、溫度65 ℃、時(shí)間60 min，實(shí)測(cè)值為14.56 %，相對(duì)偏差0.14%，可見該模型能較好地反映酶解的還原糖含量條件。

3 結(jié) ?論

本文對(duì)板栗漿的酶解工藝進(jìn)行研究，首先對(duì)影響酶解工藝的因素酶加量、料液比、溫度、時(shí)間、pH值進(jìn)行了研究，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析建立了回歸方程：

Y=+14.56+0.37A+0.013B+0.22C-0.084D-1.06AB-0.066AC+0.48AD+0.17BC+0.52BD+0.52CD-2.35A2-1.64B2-2.14C2-1.25D2。通過方差分析和失擬項(xiàng)分析，證明該模型擬合度較好。由F檢驗(yàn)得到因子貢獻(xiàn)率為酶加量>溫度>時(shí)間>pH值。利用優(yōu)化模型得到最佳提取條件為酶加量0.3%、pH值6、溫度65 ℃、時(shí)間60 min，還原糖含量可達(dá)14.56%。為板栗的酶解工藝提供了理論依據(jù)，為板栗制品的加工奠定了理論基礎(chǔ)。

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