HPLC法同時(shí)測(cè)定小檗堿甲氧芐啶膠囊中2種組分的含量

于文萃，高毓?jié)邙P斌

(1.遼寧地質(zhì)工程職業(yè)學(xué)院，丹東 118000；2.丹東市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，丹東 118002)

小檗堿甲氧芐啶膠囊為復(fù)方制劑，主要成分為鹽酸小檗堿和甲氧芐啶，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)[1]，鹽酸小檗堿對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌均有抑制作用，其中對(duì)溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、志賀菌屬、腦膜炎奈瑟菌、白喉?xiàng)U菌和傷寒桿菌等的抑制作用較強(qiáng)。甲氧芐啶[2]干擾細(xì)菌葉酸代謝，選擇性抑制二氫葉酸還原酶和核酸的合成。二者組成復(fù)方制劑的抗菌作用較單藥增強(qiáng)，耐藥菌株減少，臨床用于敏感菌所致的胃腸炎和細(xì)菌性痢疾等腸道感染疾病。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]對(duì)其組分鹽酸小檗堿、甲氧芐啶分別采用HPLC法和紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，步驟繁瑣，操作不便，樣品消耗量大，為了提高檢驗(yàn)效率，簡(jiǎn)化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]，首次利用HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-10AT高效液相色譜系統(tǒng)，島津SPD-10A(UV-Vis Detector)，島津Labsolution 色譜工作站[島津(中國(guó))有限公司]；SK8200HP超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；JJ500型精密電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng))；XS-205十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-201212，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%)，甲氧芐啶對(duì)照品(批號(hào)100031-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；小檗堿甲氧芐啶膠囊(每粒含鹽酸小檗堿100 mg，甲氧芐啶50 mg)為市售；磷酸二氫鉀(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng))；甲醇、乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為自制去離子超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備 分別取鹽酸小檗堿和甲氧芐啶對(duì)照品23.13和10.37 mg，置于同一100 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，取上述儲(chǔ)備液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為40.11和20.70 μg·mL-1的鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的混合對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.214 6 g(含鹽酸小檗堿和甲氧芐啶100和50 mg)，置于250 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，置于100 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，即得。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(30∶70)為流動(dòng)相；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。色譜圖見(jiàn)圖1。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)分別按照鹽酸小檗堿和甲氧芐啶峰計(jì)算均不低于5 000，分離度符合要求。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性輔料溶液；1.甲氧芐啶；2.鹽酸小檗堿。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution;B.sample solution;C.negative excipients solution；1.trimethoprim；2.berberine hydrochloride.

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線(xiàn)性范圍 精密量取2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0，10.0，15.0，20.0和25.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制得系列對(duì)照品溶液。按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，經(jīng)回歸分析，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在10.026 9～50.134 3 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為：y1=9.324×104x1-1.051×104，r1=0.999 9；甲氧芐啶在5.174 6～25.873 2 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為:y2=2.467×104x2+3.960×103，r2=0.999 5。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，鹽酸小檗堿和甲氧芐啶峰面積的RSD值分別為0.4%和0.6%(n=6)。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取10粒小檗堿甲氧芐啶膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)取細(xì)粉，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，分別于0，2，4，8，12，16和24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，鹽酸小檗堿和甲氧芐啶峰面積的RSD值分別為0.7%和0.5%(n=7)。

2.4.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批小檗堿甲氧芐啶膠囊內(nèi)容物細(xì)粉6份，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，按照外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的含量分別為標(biāo)示量的96.8%和100.2%，RSD值分別為0.2%和0.5%(n=6)。

2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量(鹽酸小檗堿96.3%，甲氧芐啶100.1%)的小檗堿甲氧芐啶膠囊(批號(hào)161203)細(xì)粉(含鹽酸小檗堿100 mg，甲氧芐啶50 mg)6份，置于250 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液適量，使溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液2.5 mL，置于50 mL量瓶中，加入含鹽酸小檗堿和甲氧芐啶質(zhì)量濃度分別為200.54 和103.49 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液4.0，5.0和6.0 mL，各2份，加體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得加樣回收樣品溶液。按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，鹽酸小檗堿的平均回收率為99.9%，RSD值為0.3%(n=6)，甲氧芐啶的平均回收率為99.5%，RSD值為0.8%(n=6)，見(jiàn)表1。

表1鹽酸小檗堿和甲氧芐啶回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Determination results of recovery rate of berberine hydrochloride and trimethoprim

(n=6)

2.5含量測(cè)定 取2個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的小檗堿甲氧芐啶膠囊，每個(gè)廠(chǎng)家取3個(gè)批號(hào)，共計(jì)6個(gè)批次的藥品，按照2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Determination results of samples (n=3)

3 討論

3.1方法的選擇 小檗堿甲氧芐啶膠囊是由鹽酸小檗堿和甲氧芐啶組成的復(fù)方制劑，臨床藥效強(qiáng)于二者單獨(dú)使用，現(xiàn)行制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)2個(gè)組分分別進(jìn)行質(zhì)量控制，對(duì)甲氧芐啶采用紫外分光光度法進(jìn)行含量控制，該步驟繁瑣、操作不便，樣品消耗量大，同時(shí)大量使用氯仿等對(duì)人體毒害較大的有機(jī)試劑。為了簡(jiǎn)化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，避免氯仿等有毒試劑的大量使用，本文利用HPLC法建立同時(shí)測(cè)定小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶含量的方法。

3.2溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)中的溶劑同時(shí)考察了水，0.1 mol·L-1鹽酸，體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸甲醇溶液和體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液。其中水，0.1 mol·L-1鹽酸和體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸甲醇溶液均出現(xiàn)了樣品中至少1種組分溶解不完全，而以體積分?jǐn)?shù)1%的鹽酸和50%的甲醇溶液為溶劑時(shí)，樣品中2種組分完全溶解，同時(shí)液相系統(tǒng)中的溶劑峰對(duì)待測(cè)組分峰無(wú)干擾。

3.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的紫外吸收?qǐng)D譜，鹽酸小檗堿在263 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，甲氧芐啶在270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，綜合考慮鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的紫外吸收特性，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

3.4流動(dòng)相的選擇 參考相關(guān)研究[8-16]，流動(dòng)相系統(tǒng)同時(shí)考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸鹽緩沖液和甲醇-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(30∶70)流動(dòng)相系統(tǒng)可使鹽酸小檗堿和甲氧芐啶達(dá)到完全分離，且峰形良好，流動(dòng)相對(duì)待測(cè)組分的分離沒(méi)有干擾。同時(shí)也考察了不同品牌的色譜柱，分離重復(fù)性良好。

本文首次建立HPLC法同時(shí)測(cè)定小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、取樣量小，可用于小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶2種組分的質(zhì)量控制，為小檗堿甲氧芐啶膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。