腎移植穿刺標(biāo)本冰凍切片制作方法及體會(huì)

余鑫鑫，陳陽，閻紅琳，袁靜萍

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院1病理科，2麻醉科，武漢 430060）

冰凍切片是病理科的急診工作，要求病理醫(yī)師在很短的時(shí)間內(nèi)做出正確的診斷，為手術(shù)醫(yī)生下一步的手術(shù)方案提供指導(dǎo)。在腎移植手術(shù)中，影響腎移植效果的因素有很多，如排斥反應(yīng)、各種并發(fā)癥導(dǎo)致的損傷等[1]，這就要求臨床醫(yī)生對(duì)供腎功能狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，除臨床評(píng)分及肉眼評(píng)估外，病理活檢是評(píng)估移植腎功能，預(yù)測(cè)器官分配或遠(yuǎn)期存活的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。臨床將供腎穿刺標(biāo)本取出送病理科進(jìn)行快速病理活檢，而冰凍切片質(zhì)量的好壞直接決定診斷的快速、客觀、準(zhǔn)確、合理，因此，一張快速優(yōu)質(zhì)的供腎穿刺標(biāo)本冰凍切片顯得尤為關(guān)鍵。腎穿刺標(biāo)本比較柔嫩細(xì)小，在冰凍切片制片過程中常出現(xiàn)切片缺損、褶皺、刀痕、裂隙、染色不均、對(duì)比度差等問題，給制片和診斷帶來一定困難，為解決上述問題，作者經(jīng)過10例供腎穿刺標(biāo)本的實(shí)踐摸索，總結(jié)出切片和染色質(zhì)量既快又好的腎移植穿刺標(biāo)本冰凍切片制作方法，現(xiàn)介紹如下。

材料與方法

1 材料

1.1 研究對(duì)象

選取2017年武漢大學(xué)人民醫(yī)院手術(shù)室提供的10例腎移植供體穿刺標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑

德國Leica CM1950恒溫冷凍切片機(jī)，溫度處于（-25～ -20）℃；愛華牌烤片機(jī)，溫度處于（65～70）℃；普通膠水；新鮮Harris蘇木素染液；1%鹽酸酒精；0.5%氨水；各級(jí)梯度酒精；環(huán)保透明液；中性樹膠；1%醇溶性酸化伊紅染液：1g醇溶性伊紅、100ml 95%乙醇、加幾滴冰醋酸至半透明狀；改良AFA固定液：無水乙醇75ml、40%甲醛10ml、丙酮 10ml、冰醋酸 5ml。

2 方法

2.1 兩步法包埋

接收到腎穿刺標(biāo)本后，首先在樣本托上，均勻涂抹一層普通膠水，再將樣本托放置于冰凍切片機(jī)冷凍錘下，輕輕壓平成型半分鐘，取出樣本托，將標(biāo)本平鋪成一條直線放于樣本托上；其次在放置好的標(biāo)本上，均勻涂抹一層普通膠水，至全部覆蓋標(biāo)本，并用冷凍錘輕輕壓平成型1min，這樣既能將組織墊高，又能使組織平整，便于組織切全（圖1）。

圖1 兩步法包埋操作步驟Fig. 1 Two-step embedding procedure

2.2 先粗修再細(xì)切方式切片

標(biāo)本冷凍完成后，首先將樣本托固定在切片機(jī)的機(jī)頭上，調(diào)整機(jī)頭的位置使其恰好位于切片刀的后方，其次將切片厚度調(diào)至最小厚度1μm，左手按一下前進(jìn)鍵，隨即右手沿逆時(shí)針方向緩慢均勻地將手柄從最高點(diǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)1/4圈后回位，使標(biāo)本由上至下均勻在切片刀口上完整刮過一次，以此粗切削的方式進(jìn)行標(biāo)本的粗修至暴露出標(biāo)本的最大平面。然后將切片厚度調(diào)為3μm進(jìn)行細(xì)切，右手順時(shí)針勻速轉(zhuǎn)動(dòng)手柄，清除頭兩張切片和平臺(tái)上的組織碎屑，隨手柄的勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，左手持毛筆輕帶組織下方的白邊（普通膠水冷凍后形成的白色固體），使切片從下至上完整平坦的展開，右手持載玻片輕輕平穩(wěn)地壓下組織，使其平整地吸附在載玻片上，迅速放入固定液固定。

2.3 改良AFA固定液固定與HE染色

切片完成后迅速放入改良AFA固定液中固定30s。稍水洗終止固定，然后將切片放置于烤片機(jī)支架上，均勻滴加蘇木素染液，染色半分鐘（春夏季半分鐘，秋冬季1min），稍水洗，1%鹽酸酒精分化1～2s，稍水洗終止分化，0.5%氨水反藍(lán)5s，稍水洗，均勻滴加酸化伊紅染液，染色5s，稍水洗，依次各級(jí)梯度酒精脫水，環(huán)保透明液透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察。

3 冰凍切片及HE染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

切片應(yīng)組織完整，無明顯缺損、褶皺、刀痕、裂隙。染色應(yīng)全片透明度好，顏色深淺適度，色彩鮮艷，紅藍(lán)對(duì)比鮮明，無偏色；蘇木素染細(xì)胞核應(yīng)核膜、核仁清晰，胞質(zhì)和纖維均無蘇木素共染現(xiàn)象；伊紅染胞漿應(yīng)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)粉紅色，層次分明。

結(jié) 果

10例腎移植供體穿刺標(biāo)本通過顯微鏡下觀察：切片組織完整，大部分切片無缺損、褶皺、刀痕、裂隙；HE染色顯示顏色深淺適度，色彩鮮艷，核膜、核仁染色清晰，與胞漿染色紅藍(lán)對(duì)比鮮明，無偏色，對(duì)比度好（圖2）；制片時(shí)間11.5～14min，平均制片時(shí)間12.9min（表1）。

討 論

腎移植穿刺標(biāo)本組織量較少，而且在處理過程中易斷裂、破碎、丟失，因此在快速制片的每一個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)謹(jǐn)慎處理，作者收集10例腎移植穿刺活檢組織標(biāo)本，在組織的冰凍溫度設(shè)定、包埋、切片、固定、染色方面總結(jié)出一套既保證切片質(zhì)量又快速的制片方法。

圖2 腎移植穿刺標(biāo)本冰凍切片HE染色。比例尺，50μm。Fig. 2 HE staining of frozen section of renal transplantation needle biopsy specimen. Scale bar, 50μm

表1 10例腎移植供體穿刺標(biāo)本冰凍切片染色結(jié)果Tab. 1 HE staining results of 10 cases of renal transplantation needle biopsy specimen frozen section

1 冰凍切片的溫度設(shè)定

腎移植穿刺標(biāo)本直徑一般在1～2mm，長度一般為5～20mm[3]，組織柔軟稚嫩，對(duì)切片溫度有很高的要求，溫度過低容易使穿刺組織硬度過大，切片時(shí)組織呈碎屑狀，而溫度過高又使組織的硬度不夠，使切片不能成形[4]。根據(jù)我們?cè)诖┐探M織冰凍切片中的經(jīng)驗(yàn)，本研究將腎移植穿刺標(biāo)本的冰凍切片機(jī)溫度調(diào)在（-25～ -20）℃之間，切片效果良好。

2 包埋

傳統(tǒng)的大組織在進(jìn)行冰凍切片時(shí)往往無包埋步驟，而腎臟穿刺組織較小呈細(xì)條狀且很珍貴，為使切片平坦完整，在制作冰凍切片過程中作者用兩步法包埋組織，首先在樣本托上用普通膠水凍制一個(gè)平整的小冷臺(tái)，將組織放在小冷臺(tái)上平鋪成一條直線，這樣既可使組織墊高，又可防止因組織過小切片過度，刀刃切到樣本托而造成刀片和機(jī)器損傷[5]；其次再用膠水將組織全部覆蓋，于冷凍錘下輕輕壓平，對(duì)標(biāo)本完成雙面包埋，利于后續(xù)切片的平坦及完整。已有研究顯示普通膠水可替代進(jìn)口OCT包埋劑用于冰凍切片的包埋，且在多種組織上取得很好的效果[6]，我科從2015年至今一直使用普通膠水作為冰凍切片的包埋劑，既節(jié)約成本，效果又很理想。

3 切片

本研究采用先粗修再細(xì)切的切片方法，粗修至暴露出組織最大面，以保證組織切全。粗修時(shí)一定要謹(jǐn)慎小心勻速進(jìn)行，將切片厚度調(diào)為最小，以免因粗心大意或速度過快導(dǎo)致粗修過度而造成珍貴組織的缺損甚至丟失。組織修出最大面即停止粗修，將切片厚度調(diào)為3μm，因?yàn)榻M織細(xì)胞內(nèi)含有水分，在（-25～ -20）℃的溫度下，組織細(xì)胞會(huì)發(fā)生膨脹，調(diào)大切片厚度為3μm以保證在同一橫截面切出最多的細(xì)胞。

4 固定

改良AFA固定液已被作者研究在冰凍切片固定中有優(yōu)于其它固定液的表現(xiàn)[7]，其成分包括無水乙醇、甲醛、丙酮、冰醋酸，混合后立即使用。純酒精的脫水作用比較強(qiáng)，但硬化組織快，對(duì)組織有明顯的收縮作用；甲醛穿透力強(qiáng)，固定均勻，能增加組織的韌性；冰醋酸雖不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白，對(duì)細(xì)胞核固定效果好，也能使組織膨脹；丙酮能迅速固定蛋白質(zhì)，穿透力極強(qiáng)，進(jìn)一步縮短固定時(shí)間。丙酮跟冰醋酸都能使組織膨脹，聯(lián)合應(yīng)用既能抵消酒精固定所引起的組織高度收縮和硬化，又能加速固定，兼?zhèn)淇焖倜撍凸潭ㄗ饔肹8]。因此切片經(jīng)改良AFA固定液固定能提高固定效果，縮短固定和脫水時(shí)間。

5 染色

在伊紅染色液的配制過程中，作者加入適量的冰醋酸，其目的是為了增強(qiáng)組織細(xì)胞的染色力。伊紅是一種酸性紅色細(xì)胞質(zhì)染料，在溶液中電離帶負(fù)電，易與帶正電荷的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合而使其染色。細(xì)胞質(zhì)的等電點(diǎn)為pH4.7～5.0，在伊紅染液中加入冰醋酸就是把pH值調(diào)到細(xì)胞質(zhì)等電點(diǎn)pH4.7以下，促使胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)發(fā)生堿式電離帶正電，易與帶負(fù)電的酸性染料伊紅結(jié)合在一起[9]，進(jìn)一步縮短染色時(shí)間。

結(jié)合以上冰凍切片機(jī)溫度選擇，普通膠水使用，兩步法包埋，改良AFA固定液固定以及HE染色中酸化伊紅的應(yīng)用，大大提高了腎移植穿刺標(biāo)本冰凍切片的質(zhì)量和制片速度，很好的服務(wù)了腎移植患者，具有臨床實(shí)用價(jià)值，值得推廣。