冰醋酸對水溶性伊紅Y染液的影響及應(yīng)用比例

曹金雷

[摘要] 目的 探討水溶性伊紅Y染液中未加入冰醋酸時和逐步加入冰醋酸后其染色能力的變化及在實際應(yīng)用中應(yīng)加入的合適比例使染液能達(dá)到最佳的染色效果。 方法 選取近期接收的標(biāo)本，常規(guī)脫水包埋切片。在各組切片進(jìn)行染色時，在水溶性伊紅Y染液內(nèi)逐步加入冰醋酸，并記錄下各組切片染色時水溶性伊紅Y染液內(nèi)的冰醋酸的量，最后顯微鏡下觀察各組切片的染色效果以明確目的。 結(jié)果 當(dāng)水溶性伊紅Y染液內(nèi)未加入冰醋酸時其染色能力較差，切片不易染色。隨著染液內(nèi)加入的冰醋酸逐漸增多，染液的染色能力逐漸增強(qiáng)，切片內(nèi)各物質(zhì)染色越深。當(dāng)染液內(nèi)加入的冰醋酸比例約0.5%時，染液的染色效果最佳，細(xì)胞核與細(xì)胞漿的對比度較好，可符合診斷要求。加入過多冰醋酸后染液的染色能力過強(qiáng)，切片被伊紅深染，細(xì)胞核也被染色而呈現(xiàn)紫色，對比度下降，從而影響診斷。 結(jié)論 冰醋酸可使水溶性伊紅Y染液的染色能力增強(qiáng)。但加入過多的冰醋酸后水溶性伊紅Y染液的染色能力過強(qiáng)，切片的整體染色效果反而下降。因此在實際應(yīng)用中冰醋酸的量需控制在一定范圍（約0.5%時）內(nèi)，使染液的染色能力適中，使細(xì)胞質(zhì)易被伊紅染液染成不同色調(diào)的紅色而細(xì)胞核不被染色，從而能形成鮮明對比，達(dá)到診斷要求。

[關(guān)鍵詞] 冰醋酸;常規(guī)染色;水溶性伊紅Y;Gill改良蘇木素染液

[中圖分類號] R361 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）24-0141-04

[Abstract] Objective To explore the dyeing ability of water-soluble eosin Y dyeing solution without adding glacial acetic acid and after gradually adding glacial acetic acid， and to explore the appropriate ratio should be added in practical application to achieve the best dyeing effect. Methods The recently received specimens were selected and the conventional dehydrated embedded sections were used. When staining each group of slices， the amount of glacial acetic acid was gradually added to the water-soluble eosin Y dye solution， and the amount of glacial acetic acid in the water-soluble eosin Y dyeing solution was recorded under the staining each group of slices. The staining effect of each group of slices was used for a clear purpose. Results When glacial acetic acid was not added to the water-soluble eosin Y dyeing solution， its dyeing ability was poor， and the slice was not easy to stain. As the glacial acetic acid added to the dyeing solution gradually increased， the dyeing ability of the dyeing solution gradually increased， and the dyeing of the substances in the slices was deeper. When the proportion of glacial acetic acid added to the dyeing solution was about 0.5%， the dyeing effect of the dyeing solution was the best， and the contrast between the nucleus and the cytoplasm was good， which could meet the diagnostic requirements. After adding too much glacial acetic acid， the staining ability of the dyeing solution was too strong， the slice was deeply stained with eosin， the nucleus was also stained to appear purple， and the contrast was decreased， thereby affecting the diagnosis. Conclusion Glacial acetic acid can enhance the dyeing ability of water-soluble eosin Y dyeing solution. However， the dyeing ability of the water-soluble eosin Y dye solution is too strong after adding too much glacial acetic acid， and the overall staining effect of the slice decreases. Therefore， in practical applications， the amount of glacial acetic acid needs to be controlled within a certain range （about 0.5%）， so that the dyeing ability of the dyeing solution is moderate， and the cytoplasm is easily dyed into red with different shades and the nucleus is not stained. This will create a sharp contrast and meet diagnostic requirements.

[Key words] Glacial acetic acid; Conventional dyeing; Water-soluble eosin Y; Gill modified hematoxylin dyeing solution

蘇木精-伊紅染色法是病理常規(guī)制片中最為重要的染色方法，其中蘇木精染液將細(xì)胞核染成藍(lán)色，而伊紅染液的作用是顯示出細(xì)胞漿、嗜酸性顆粒、肌纖維和膠原纖維等結(jié)締組織的不同色調(diào)的紅色，與細(xì)胞核的藍(lán)色形成鮮明對比。隨著現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展，在日常病理技術(shù)工作中使用了大量的全自動標(biāo)準(zhǔn)化器械，但是全自動染色機(jī)在進(jìn)行常規(guī)染色時仍會出現(xiàn)病理切片藍(lán)紅對比失調(diào)的現(xiàn)象，為能染出符合病理診斷對常規(guī)切片染色的要求[1]，除了要確保染色程序的正常及正確地使用各類試劑[2]，還需要配制出優(yōu)良的蘇木精染液和染色能力適中、染色效果穩(wěn)定的伊紅染液，才能使切片內(nèi)的核漿染色分明，核漿形成鮮明的對比。在實際工作中要配制出染色能力適中、染色效果穩(wěn)定的伊紅染液也絕非易事，其中冰醋酸有著至關(guān)重要的影響，需加入適量的冰醋酸方能達(dá)到最佳的染色效果。在很多文獻(xiàn)及書籍中對于水溶性伊紅Y的配制方法中所提及的加入冰醋酸的量以每100 mL加入1滴計算[3]，對于配制大量染液時并未說明具體百分比。因此，使用此法配制出的伊紅染液，每次所加入的冰醋酸的量不盡一致，不能保證每次所配制出的伊紅染液的染色能力均相當(dāng)。因此，為保證每次均能配制出染色性能穩(wěn)定、能力適中的伊紅染液，就需要摸索出冰醋酸對伊紅染液染色能力的具體影響及加入最佳比例，在此以水溶性伊紅Y染液為研究對象，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選擇義烏市中心醫(yī)院病理科近期接收的標(biāo)本：要求使用中性甲醛液[4]固定，固定效果良好，并充分脫水的標(biāo)本（為保證標(biāo)本充分固定及脫水，標(biāo)本大小以2 cm×1.5 cm×0.2 cm左右[5]為宜），包括子宮肌瘤2例、闌尾2例、肝臟2例及淋巴結(jié)組織2例。

1.2 試劑

中性甲醛液（義烏市中心醫(yī)院制劑室，規(guī)格：10 L/桶），Gill改良蘇木精染液[6]：蘇木素2 g（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：Q/CYDZ2483-2012，規(guī)格：10 g/瓶），無水乙醇250 mL（安特食品股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB/T678-2002，規(guī)格：500 mL/瓶），硫酸鋁鉀17.6 g（廣東西隴化工廠，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB1275-94，規(guī)格：500 g/瓶），蒸餾水750 mL（義烏市中心醫(yī)院制劑室，規(guī)格：50 L/桶），碘酸鈉0.2 g（上海），冰醋酸20 mL（西隴化工股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB/T676-2007，規(guī)格：500 mL/瓶）;水溶液性伊紅Y染液：水溶性伊紅Y 6 g（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：18919505，規(guī)格：10 g/瓶），80%酒精900 mL（自行配制），蒸餾水100 mL，冰醋酸若干;40%酒精（自行配制），75%酒精（自行配制），85%酒精（自行配制），95%酒精（嵊州市天馬消毒劑廠，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：Q/SY001-2008，規(guī)格：5000 mL/瓶），無水乙醇，二甲苯（上海聯(lián)試化工試劑有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB/T16494-1996，規(guī)格：500 mL/瓶），石蠟（福建啟盛實驗設(shè)備科技有限公司，規(guī)格：1000 g/袋）。

1.3 器械

LEICA ASP300S全自動脫水機(jī)，LEICA EG 1150H石蠟包埋機(jī)，LEICA EG 1150C冷凍臺，LEICA RM2235石蠟切片機(jī)，YT-6C生物組織攤烤片機(jī)，LEICA AUTOSTAINER XL全自動切片染色機(jī)，LEICA CV5030全自動封片機(jī)，LEICA DMLB顯微鏡。

1.4 方法

所有的組織標(biāo)本，全部由LEICA ASP300S全自動脫水機(jī)[7]脫水，使用LEICA EG 1150H石蠟包埋機(jī)[8]和LEICA EG 1150C冷凍臺進(jìn)行塑料包埋盒包埋[9]，使用LEICA RM2235石蠟切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)石蠟切片[10-11]，切片厚度為4 μm[12]，先在40%酒精里預(yù)展片[13]，后在49℃的水溫中裱片[14]，連續(xù)切片10張，對切片依次進(jìn)行數(shù)字編號（從1～10），立即放入65℃的烤箱內(nèi)烤片半小時[15]，烤片使用的是YT-6C生物組織攤烤片機(jī)。為盡量減少人為因素對切片染色效果的影響，在整個切片染色過程中使用全自動染色機(jī)進(jìn)行染色及全自動封片機(jī)封片[16]：使用LEICA AUTOSTAINER XL全自動切片染色機(jī)[17]對各組切片（同一個數(shù)字編號的切片為同一組）分別進(jìn)行染色。在切片染色過程中使用相同的染色程序，不改變其他試劑的前提下，水溶性伊紅Y染液內(nèi)未加入冰醋酸時和逐漸加入冰醋酸后分別使用不同編號的一組切片進(jìn)行染色，如水溶性伊紅Y染液內(nèi)未加入冰醋酸時，使用編號為1的一組切片進(jìn)行染色;當(dāng)向水溶性伊紅Y染液內(nèi)加入0.5 mL冰醋酸時，使用編號為2的一組切片進(jìn)行染色，依次類推，直至完成所有的切片染色，每次添加冰醋酸時進(jìn)行充分?jǐn)嚢枰员ＷC混合均勻。水溶性伊紅Y染液內(nèi)加入越多的冰醋酸后使用編號越大的切片進(jìn)行染色，并記錄每組切片進(jìn)行染色時水溶性伊紅Y染液內(nèi)冰醋酸的量。切片染色完成后立即使用LEICA CV5030全自動封片機(jī)[18]封片。最后在顯微鏡下觀察各組切片的染色效果，以明確冰醋酸對水溶性伊紅Y染液的染色能力的影響，最后選擇出染色效果好，紅藍(lán)分明，顏色程度適中，核漿對比度最好的切片，查看編號對照伊紅染液內(nèi)所加入的冰醋酸的量，以明確冰醋酸對水溶性伊紅Y染液的影響及最佳應(yīng)用比例。

2 結(jié)果

2.1 水溶性伊紅Y染液內(nèi)未加入冰醋酸

在顯微鏡下觀察所有制作完成的切片染色情況?？砂l(fā)現(xiàn)編號為1的同一組切片的伊紅不易著色，染色效果差，即水溶性伊紅Y染液中未加入冰醋酸時，水溶性伊紅Y染液的染色能力較弱，切片不易被水溶性伊紅Y染液所染色，伊紅染色效果差顏色不鮮艷、色澤淡與細(xì)胞核的藍(lán)色對比度不明顯（封三圖5）。

2.2 水溶性伊紅Y染液內(nèi)逐漸加入冰醋酸

切片的編號逐漸增大，切片內(nèi)的伊紅染色效果逐漸加深，即隨著水溶性伊紅Y染液中的冰醋酸逐漸增多，水溶性伊紅Y染液的染色能力逐漸增強(qiáng)。經(jīng)過仔細(xì)對比各組切片的染色結(jié)果及參照文獻(xiàn)的伊紅染色標(biāo)準(zhǔn)[19]后，確定編號為4的切片內(nèi)的伊紅染色程度適中，染色效果好，可使切片內(nèi)的細(xì)胞漿、嗜酸性顆粒、肌纖維和膠原纖維等結(jié)締組織的不同色調(diào)的紅色，與細(xì)胞核的藍(lán)色形成較為鮮明對比，可符合病理診斷對切片染色的要求（封三圖6）。

2.3 水溶性伊紅Y染液內(nèi)加入過多冰醋酸

編號過大的切片內(nèi)伊紅染色過深，即水溶性伊紅Y染液內(nèi)加入過多的冰醋酸后，使伊紅染液的染色能力過強(qiáng)，切片內(nèi)各物質(zhì)均被水溶性伊紅Y染液深染，出現(xiàn)顏色較均勻一的深紅色，且出現(xiàn)核漿共染現(xiàn)象，使細(xì)胞核也被水溶性伊紅Y染液所染色，致細(xì)胞核原已被蘇木素染液染成的藍(lán)色與伊紅的紅色重疊，使細(xì)胞核呈現(xiàn)紫色，反而使細(xì)胞核與細(xì)胞漿的對比度下降，不能符合病理診斷的要求，影響診斷（封三圖7）。

3 討論

病理科診斷醫(yī)師在進(jìn)行常規(guī)病理診斷時先通過顯微鏡直接觀察組織切片內(nèi)各細(xì)胞的形態(tài)和各成分的染色情況來初步診斷病理結(jié)果及判斷是否需要進(jìn)一步免疫組織化學(xué)檢查或分子病理檢查等。目前在病理科常規(guī)病理制片染色過程中仍以經(jīng)典的蘇木素-伊紅染色法為主，也是病理技術(shù)員在日常工作中所必須熟練掌握并努力做好的一種染色方法[20]。為保證制作一張能符合診斷要求的病理切片，除了要有良好的固定和徹底的脫水外，切片的染色效果也是非常重要的，只有保證各類標(biāo)準(zhǔn)化器械內(nèi)使用的試劑狀態(tài)良好和器械運(yùn)行程序的正確使用，才可使器械所處理的標(biāo)本達(dá)到制作要求，其中最重要的是配制出染色效果好、染色性能穩(wěn)定的蘇木素染液和伊紅染液。

蘇木素是一種純天然染料，是從蘇木素樹提煉出來的，蘇木素樹主產(chǎn)墨西哥的坎佩切，蘇木素染色性能差，經(jīng)過一百多年精心加工配制，現(xiàn)在的蘇木素配方，染色性能好，保持時間長，是世界上唯一的常規(guī)細(xì)胞核染料，在水中可解離成帶正電荷的堿性染料。細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性[21]，很容易與帶正電荷的蘇木素堿性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木素染色完成后需要使用弱堿性溶液進(jìn)行藍(lán)化處理，因為蘇木素在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。伊紅是一種人工合成的化學(xué)試劑，是由醌式苯環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)色基團(tuán)和鹵素原子溴及鈉鹽的助色基團(tuán)所組成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，能與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明對比，以達(dá)到病理診斷對常規(guī)切片染色的要求。

從實驗結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)冰醋酸對水溶性伊紅Y染液的染色能力有著至關(guān)重要的影響，因為細(xì)胞漿的主要化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，其次是核糖核酸（RNA）和脂蛋白質(zhì)，大多為兩性化合物，細(xì)胞漿的等電點pH為4.7～5.0。細(xì)胞漿是呈現(xiàn)酸式電離還是呈現(xiàn)堿式電離受溶液pH值的影響，而冰醋酸是一種酸性液體，加入水溶性伊紅Y染液后可降低溶液的pH值。如封三圖5當(dāng)伊紅染液中未加入冰醋酸時，其溶液pH值大于細(xì)胞質(zhì)等電點，抑制了細(xì)胞質(zhì)的堿式電離，表現(xiàn)酸式電離，從而成為帶負(fù)電荷的陰離子，不易被水溶性伊紅Y這一類酸性染料染色，因此切片染色效果不理想，顏色不鮮艷、色澤淡，切片內(nèi)成分層次不清楚，不能與細(xì)胞核的藍(lán)色形成鮮明對比，不符合常規(guī)切片染色的要求。結(jié)合實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)向水溶性伊紅Y染液內(nèi)逐漸加入冰醋酸后，其染液的pH值逐漸減低，水溶性伊紅Y染液的染色能力逐漸增強(qiáng)，使切片內(nèi)的染色程度越來越深（切片更紅），與細(xì)胞核的藍(lán)色對比度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)水溶性伊紅Y染液中加入適量的冰醋酸時，使水溶性伊紅Y染液的pH值低于細(xì)胞質(zhì)等電點，此時細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為堿式電離，成為帶正電荷的陽離子，易被帶負(fù)電荷的酸性伊紅染料染色，而染液的pH值仍高于染色體等電點，細(xì)胞核仍表現(xiàn)為酸式電離，成為帶負(fù)電荷的陰離子，不易被水溶性伊紅Y染色，不使細(xì)胞核染色。封三圖6中水溶性伊紅Y染液中加入約0.5%的冰醋酸，其溶液pH值正位于此區(qū)間內(nèi)（低于細(xì)胞質(zhì)等電點而高于細(xì)胞核等電點），可使細(xì)胞漿內(nèi)的物質(zhì)被伊紅染成不同色調(diào)的紅色，層次分明，而細(xì)胞核不被伊紅染色，保持原有的藍(lán)色，細(xì)胞漿和其他組織成分呈現(xiàn)出深淺不一的紅色與細(xì)胞核的藍(lán)色形成較為鮮明的對比，可符合診斷對常規(guī)切片的染色標(biāo)準(zhǔn)，易于診斷。封三圖7時水溶性伊紅Y染液內(nèi)加入過多冰醋酸時，水溶性伊紅Y染液的染色能力過強(qiáng)，使切片內(nèi)的各物質(zhì)被染的過深過濃而呈現(xiàn)較均一的深紅色;且此時水溶性伊紅Y染液的pH值低于染色體的等電點，使染色體也呈現(xiàn)為堿式電離，成為帶正電荷的陽離子，易被水溶性伊紅Y這一類帶負(fù)電的酸性染料染色，使伊紅的紅色與細(xì)胞核原有的藍(lán)色發(fā)生重疊現(xiàn)象而呈現(xiàn)紫色。切片內(nèi)出現(xiàn)核漿共染現(xiàn)象后反而使核漿的對比度下降，影響診斷，且過深的染色使得病理醫(yī)生在進(jìn)行常規(guī)閱片時容易產(chǎn)生視覺疲勞，不利于長時間工作。

綜上，向水溶性伊紅Y染液中加入冰醋酸后可使染液內(nèi)的pH值降低，水溶性伊紅Y染液對切片的染色能力增強(qiáng)，冰醋酸的量越多，染色能力越強(qiáng)。當(dāng)在水溶性伊紅Y染液內(nèi)加入0.5%的冰醋酸時，染液的染色能力適中，染色效果最好，使切片內(nèi)各物質(zhì)呈現(xiàn)不同色調(diào)的紅色與細(xì)胞核的藍(lán)色形成鮮明對比，可符合診斷對常規(guī)切片染色的要求。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李志娟，王欣. 優(yōu)級蘇木精-伊紅切片的質(zhì)量要求[J]. 淮海醫(yī)藥，2008，26（6）：535.

[2] 黃泳軍，駱新蘭，朱小蘭，等. 全自動染色機(jī)脫水、透明試劑量與效果的分析[J]. 診斷病理學(xué)雜志，2018，25（9）：662-663.

[3] 王伯沄，李玉松，黃高昇，等. 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：133.

[4] 王友芳，林媛，饒萬新，等. 4%中性甲醛固定液制備及質(zhì)量評價[J]. 海峽藥學(xué)，2013，25（7）：24-25.

[5] 王曉鴻，曹婉維. 制作優(yōu)質(zhì)HE病理組織切片的要素[J].中國實用醫(yī)藥，2011，6（6）：135-136.

[6] 趙紅艷. 改良的蘇木素-伊紅染液配制法及應(yīng)用[J]. 西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2003，24（1）：24.

[7] 廖首生，李里香. LEICA300S生物組織脫水機(jī)試劑更換時間的探討[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2009，27（3）：264-265.

[8] 李彥群，楊會釵，王珩，等. LEICA自動包埋機(jī)使用技巧[J]. 世界感染雜志，2003，3（1）：37.

[9] 彭云吉，黃孫裕，張靜，等. 塑料包埋盒包埋與傳統(tǒng)石蠟包埋框包埋方法對比研究[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究，2011， 9（22）：184-185.

[10] 楊晰朦，趙素玲. 病理組織石蠟切片制作體會及常見問題分析[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生，2017，2（5）：234.

[11] 馮晨，徐康寧. 石蠟切片機(jī)巧用的方法及體會[J]. 新疆醫(yī)學(xué)，2012，42（9）：107-108.

[12] 席越，陳軍. 病理技術(shù)大講堂1001問[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：50.

[13] 陳蘭英，蘭春蓮. 介紹一種快速展片法[J]. 浙江實用醫(yī)學(xué)，2001，6（5）：59.

[14] 湯鴻. 病理制片中展片與水溫關(guān)系的探討[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，25（7）：771.

[15] 錢金林，王登山，李林秋，等. 烤片方法對不同組織類型切片皺褶產(chǎn)生的影響[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2016，32（11）：1301-1303.

[16] 范玲麗. 全自動染色機(jī)及封片機(jī)在病理制片中的應(yīng)用[J]. 臨床合理用藥雜志，2016，9（13）：152-153.

[17] 何杰. 蘇木素-伊紅組織染色在全自動組織切片染色機(jī)中的使用技巧[J].實用醫(yī)技雜志，2011，18（11）：1206-1207.

[18] 吳燕杏，韓福蘭. Leica自動染色蓋片機(jī)應(yīng)用于蘇木素一伊紅染色的體會[J]. 實用醫(yī)技雜志，2013，20（2）：199-200.

[19] 丁偉，王德田. 簡明病理學(xué)技術(shù)[M]. 杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2014：31.

[20] 陳瑛. 淺談如何做好蘇木素、伊紅染色[J]. 實用醫(yī)技雜志，2004，11（6）：879-880.

[21] 謝武堂. 演示DNA分子結(jié)構(gòu)模型[J]. 教學(xué)儀器與實驗，2008，24（8）：50-51.

（收稿日期：2019-01-14）