用DNA倍體分析方法判斷宮頸癌前病變的發(fā)展趨勢(shì)

楊秀瑋，張路偉，周亮，李瑩，孫小蓉

（1喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院婦二科，喀什844000；2武漢蘭丁云醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430206）

宮頸癌的發(fā)展過(guò)程包括炎癥、癌前病變（cervical intraepithelial neoplasia, CIN）[包 括 CIN1、CIN2和CIN3/ 原位癌（carcinoma in situ, CIS)]和浸潤(rùn)性宮頸癌等過(guò)程。癌前病變的發(fā)展趨向有3種，大多

數(shù)恢復(fù)正常，部分停留在原狀態(tài)，少數(shù)發(fā)展為浸潤(rùn)癌[1]。而臨床對(duì)癌前病變的處理也不一樣：CIN1原則上不處理，CIN2、CIN3/CIS需要治療，防止病變向浸潤(rùn)性宮頸癌發(fā)展。怎么判斷癌前病變的發(fā)展趨勢(shì)尤為重要。目前在臨床上常用方法有HPV病毒測(cè)定、E6/E7、Ki67蛋白測(cè)定[2-4]。高危型HPV陽(yáng)性、Ki67、E6/E7蛋白陽(yáng)性都預(yù)示著病變向嚴(yán)重方向發(fā)展的可能，而Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)愈多表示病變向嚴(yán)重方向發(fā)展的可能性愈大。DNA異倍體測(cè)定也是一種重要的腫瘤標(biāo)志物[5]，CIN病變的宮頸細(xì)胞常發(fā)現(xiàn)有異倍體細(xì)胞，尤其是在CIN2或CIN3病變。Grote報(bào)道在CIN1、CIN2和CIN3病例中，出現(xiàn)異倍體細(xì)胞率分別為54%、64%和83%[6]。Ki67蛋白是細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期時(shí)產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，也就是G1、S、G2和M期的細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的蛋白質(zhì)[7]。在癌前病變時(shí)進(jìn)入細(xì)胞增殖周期的細(xì)胞增多，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞增多。P16蛋白常發(fā)生在HPV病毒感染后出現(xiàn)[8]，P16蛋白多少也可能為宮頸病變嚴(yán)重程度的一個(gè)標(biāo)志。所以現(xiàn)在在臨床上有人結(jié)合P16和Ki67測(cè)定方法來(lái)判斷宮頸病變的發(fā)展趨勢(shì)[9,10]。目前還較少研究異倍體細(xì)胞、Ki67和P16在宮頸癌前病變關(guān)系，此文探討這三種標(biāo)志物在宮頸癌前病變的表達(dá)，尤其是DNA異倍體細(xì)胞多少與Ki67和P16蛋白表達(dá)多少的相關(guān)性。

材料和方法

76例婦女參入此研究，年齡31～53歲。每位婦女在喀什人民醫(yī)院門診就診做宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及DNA倍體分析。細(xì)胞學(xué)異?；蛘呒?xì)胞學(xué)正常，但婦科檢查肉眼觀察可疑婦女，一個(gè)月內(nèi)行陰道鏡下宮頸組織取材，做病理組織學(xué)檢查。宮頸組織蠟塊切片，行Ki67和P16免疫組織化學(xué)染色。

1 宮頸細(xì)胞DNA倍體分析

用Thionin染色后的印片由全自動(dòng)DNA檢測(cè)分析系統(tǒng)（武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司）進(jìn)行掃描處理。對(duì)每張玻片上6000個(gè)以上的細(xì)胞核進(jìn)行掃描測(cè)定，每個(gè)細(xì)胞核均得到500余個(gè)特征值，其中包括形態(tài)特征、吸光特征、具體結(jié)構(gòu)特征、Markovian和非Markovian結(jié)構(gòu)特征及長(zhǎng)度特征等。根據(jù)不同細(xì)胞成分所具有的不同特征參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)細(xì)胞分類（如正常上皮細(xì)胞、增生或異倍體細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性白細(xì)胞等）和計(jì)數(shù)。凡樣本內(nèi)發(fā)現(xiàn)異倍體細(xì)胞者為陽(yáng)性。根據(jù)異倍體細(xì)胞數(shù)多少，將陽(yáng)性組分為三個(gè)級(jí)別：1～2個(gè)異倍體細(xì)胞為I級(jí)，3～10個(gè)異倍體細(xì)胞為II級(jí)，10個(gè)以上異倍體細(xì)胞為III級(jí)。只有二倍體細(xì)胞或少數(shù)四倍體細(xì)胞者為陰性。

2 病理組織學(xué)檢查

根據(jù)WHO病理標(biāo)準(zhǔn)將76例病理病例診斷為不同類型及分成宮頸炎、CIN1、CIN2、CIN3和癌（cancer, ca）5種類型。

3 Ki67、P16免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行Ki67（Ki67單克隆抗體，1∶100，邁瑞公司）和P16（P16單克隆抗體，1∶200，邁瑞公司）染色。常規(guī)石蠟切片切二張，一張做Ki67免疫組化，另一張做P16免疫組化，切片經(jīng)脫蠟復(fù)水，切片PBS洗3次，每次5min；3%H2O2（80%甲醇）滴加在切片上，室溫靜置10min，PBS洗3次，每次5min；抗原修復(fù)，PBS洗3次，每次5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；滴加一抗50μL，室溫靜置1h或4℃過(guò)夜或37℃ 1h，4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45min，PBS洗3次，每次5min；滴加二抗50μL，室溫靜置或37℃ 1h，PBS洗3次，每次5min；DAB顯色5min，PBS或自來(lái)水沖洗10min，蘇木精復(fù)染，常規(guī)石蠟脫水透明，封片。

用Matlab軟件圖像測(cè)量Ki67和P16陽(yáng)性細(xì)胞分布在宮頸上皮中的分布區(qū)域，以宮頸上皮基底層為起點(diǎn)，計(jì)數(shù)出陽(yáng)性細(xì)胞在整個(gè)宮頸上皮的分布區(qū)域，以百分比計(jì)算。

4 統(tǒng)計(jì)方法

敏感性和特異性統(tǒng)計(jì)按標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算，在統(tǒng)計(jì)CIN1、CIN2、CIN3各組DNA倍體分析組間比較用Student’s t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜ 0.05時(shí)，表示二組之間有顯著性差別。

結(jié) 果

1 76例宮頸活檢病理和宮頸細(xì)胞DNA倍體分析結(jié)果

76例宮頸活檢病例中發(fā)現(xiàn)有24例宮頸炎、25例CIN1、14例CIN2、9例CIN3和4例Ca。76例宮頸細(xì)胞DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)有23例正常，20例為I級(jí)（1-2個(gè)異倍體細(xì)胞），13例為II級(jí)（3-10個(gè)異倍體細(xì)胞）和20例為III級(jí)（＞10個(gè)異倍體細(xì)胞）。在24例宮頸炎中，DNA倍體分析為17例正常、3例I級(jí)、4例II級(jí)；在25例CIN1中有4例正常、13例I級(jí)、5例II級(jí)、3例III級(jí)；在14例CIN2中，有1例正常、3例I級(jí)、2例II級(jí)、8例III級(jí)；在9例CIN3中，有1例正常、1例I級(jí)、1例II級(jí)、6例III級(jí)；在4例Ca中，1例II級(jí)、3例III級(jí)（表1）。

2 CIN2或CIN2以上病變宮頸DNA倍體分析的敏感性和特異性

若以DNA倍體1～2個(gè)異倍體（I級(jí)）為陽(yáng)性診斷CIN2或CIN2以上病變的敏感性為92.5%（25/27），特異性為42.8%（21/49）。以DNA倍體3～10個(gè)異倍體（II級(jí)）為陽(yáng)性，其敏感性為77.7%（21/27），特異性為75.5%（37/49）。以DNA倍體10個(gè)以上異倍體（III級(jí)）為陽(yáng)性，其敏感性為45.9%（17/27），特異性為93.8%（46/49）（表2）。

表1 76例宮頸細(xì)胞DNA倍體分析及病理學(xué)Tab.1 DNA ploidy analysis and pathology diagnosis in 76 cervix biopsies

表2 宮頸DNA倍體分析的敏感性和特異性Tab.2 Sensitivity and specificity of cervical DNA ploidy analysis

3 CIN病變DNA倍體分析、Ki67和P16分析結(jié)果

將不同級(jí)別CIN病變按DNA倍體分級(jí)而分成兩組，一組為DNA倍體正常、異常I級(jí)和II級(jí)，另一組為DNA倍體異常III級(jí)。

在25例CIN1病例中，有17例DNA倍體分析為正常、I及II級(jí)，其Ki67陽(yáng)性面積21%，P16陽(yáng)性面積為11%（圖1）；有8例DNA倍體分析為III級(jí)，其Ki67平均陽(yáng)性面積為43%，P16為23%。這兩組之間t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ki67為0.01＜P＜0.05，P16為0.01＜P＜0.05，兩組之間有顯著性差別。

圖1 1例宮頸上皮的病理診斷和Ki67、P16蛋白的分布。A，宮頸鱗-柱交界處，鱗狀上皮處診斷為CIN1；B，Ki-67陽(yáng)性核數(shù)：鱗狀上皮＜5%；C，P16INK4a鱗狀上皮下20%細(xì)胞核和胞質(zhì)棕色反應(yīng)。比例尺，100μmFig.1 Pathological diagnosis and distribution of Ki67 and P16 in cervical epithelium. A, CIN1 was diagnosed in squamous epithelium; B, Less than 5%of squamous epithelium were Ki67 positive in CIN1; C, P16INK4a positive stain was seen in 20% epithelium; scale bar, 100μm

在14例CIN2病例中，有6例DNA倍體分析為正常、I及II級(jí)，其Ki67陽(yáng)性平均面積為41%，P16平均面積為35%；8例DNA倍體分析為III級(jí)，其Ki67陽(yáng)性面積為65%，P16陽(yáng)性平均面積為52%。兩組t檢驗(yàn)比較，Ki67為P＜0.01，P16為0.01＜P＜0.05。

在CIN3中，DNA倍體分析正常、I及II級(jí)有3例，III級(jí)有6例。前組的Ki67面積為47%，后組Ki67面積為73%，t檢驗(yàn)0.01＜P＜0.05。前組的P16平均面積為59%，后組P16平均面積為84%，t檢驗(yàn)0.01＜P＜0.05。兩組之間Ki67和P16面積之差有顯著性差別（表3）。

表3 48例CIN病變的DNA倍體分析Ki67和P16分析Tab. 3 DNA ploidy analysis and Ki67 and P16 staining in 48 cases of CIN lesions

討 論

1 CIN2或CIN2以上病變大多伴有DNA倍體異常

在49例宮頸炎和CIN1病變中有12 位（25%）有3個(gè)或3個(gè)以上DNA倍體異常，而在27例CIN2或CIN2以上病變中已發(fā)現(xiàn)有20例（74%）有3個(gè)或3個(gè)以上的DNA倍體異常。此結(jié)果表明DNA倍體異常在CIN2或CIN2以上病變中發(fā)現(xiàn)的比例較高，即病變愈嚴(yán)重、宮頸細(xì)胞內(nèi)DNA倍體異常愈常見(jiàn)，很多研究均有類似的報(bào)道。DNA倍體異常作為腫瘤標(biāo)記物之一[5]，宮頸細(xì)胞若發(fā)現(xiàn)DNA倍體異常，患者需進(jìn)一步檢查來(lái)確診其病理性改變，以免延誤病情。

2 DNA倍體異常與Ki67和P16一樣可指示宮頸病變的嚴(yán)重程度

宮頸CIN病變?yōu)閷m頸癌癌前病變，CIN1絕大部分可恢復(fù)正常，很少發(fā)展為腫瘤。而CIN2或CIN3大多可恢復(fù)正?；虺掷m(xù)停止?fàn)顟B(tài)，并不會(huì)向腫瘤方向發(fā)展，只有少數(shù)病變會(huì)發(fā)展到浸潤(rùn)癌[1]，所以臨床或研究上如何判斷病變的發(fā)展?fàn)顟B(tài)尤為重要。目前臨床上常用高危型HPV、宮頸組織的Ki67和P16蛋白標(biāo)記來(lái)判斷癌變的發(fā)展趨勢(shì)。當(dāng)Ki67和P16蛋白布滿宮頸上皮全層，多提示病變較嚴(yán)重，有發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌的趨勢(shì)[1]。若這些陽(yáng)性蛋白只分布在宮頸上皮基層或中下層，多提示病變不活躍，發(fā)展為浸潤(rùn)癌的概率較低。本文研究結(jié)果表明，DNA倍體分析可與Ki67和P16一樣，用于判斷宮頸病變的發(fā)展趨勢(shì)。10個(gè)以上異倍體細(xì)胞宮頸上皮中下多伴73% Ki67和84% P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)。DNA倍體異常細(xì)胞愈多，說(shuō)明其DNA染色體愈不穩(wěn)定，Ki67和P16表達(dá)愈多，這種病變的嚴(yán)重發(fā)展可能性愈大，相反病變可恢復(fù)正?；蛲Ｖ乖谠?。

3 可用DNA倍體異常細(xì)胞來(lái)判斷宮頸病變敏感性和特異性

在宮頸篩查時(shí)，常需要了解篩查方法在判斷宮頸疾病的敏感性和特異性。敏感性即為陽(yáng)性病例的檢出率，特異性即陰性病例的正確判斷率。敏感性與特異性是一對(duì)矛盾體，敏感性愈高，特異性愈低。目前在國(guó)外用TBS診斷標(biāo)準(zhǔn)人工診斷CIN2或CIN2以上級(jí)別疾病的敏感性為42%～72%左右[11]，而此技術(shù)使用10個(gè)以上的DNA倍體異常為標(biāo)準(zhǔn)診斷CIN2或CIN2以上級(jí)別疾病的敏感性可達(dá)46%左右，而特異性可達(dá)到94%左右。因此此技術(shù)可在缺少病理學(xué)醫(yī)生的地方發(fā)揮巨大作用。我國(guó)目前宮頸癌篩查量大，醫(yī)生缺乏，將此技術(shù)用于宮頸癌篩查也是一種有效方法。

總之，CIN2或CIN2以上病變多伴有DNA倍體異常，與Ki67和P16作用一樣，DNA倍體異常可作為一個(gè)重要腫瘤標(biāo)記物之一來(lái)判斷CIN病變的發(fā)展趨勢(shì)。由于此技術(shù)可達(dá)到較高的敏感性，在一些病理醫(yī)生匱乏地區(qū)，可用作宮頸癌檢查方法之一。