乳腺冷凍切片的優(yōu)化

王玉環(huán)，楊榮水， 方慶全*

（1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003；2廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，廈門 361004）

近年來，乳腺病變尤其是乳腺癌的發(fā)病率明顯升高［1］，雖然乳腺疾病的檢查方法很多，但病理組織學(xué)診斷具有重要作用［2］。目前，術(shù)中乳腺病變冷凍切片診斷依然是制定手術(shù)方案的重要依據(jù)。冷凍制片技術(shù)是快速病理診斷的基石，如何在有限的時間內(nèi)又快又好地完成制片，不僅是病理診斷的需要，更是術(shù)中醫(yī)師的迫切要求[3]。乳腺組織冷凍制片技術(shù)受多種因素的影響，常制片質(zhì)量不穩(wěn)定，易導(dǎo)致病理診斷困難，一定程度上影響乳腺外科術(shù)中手術(shù)方案的制定。為此，作者通過實驗，從取材大小、速凍方法、切片厚度等方面探討乳腺冷凍切片的優(yōu)化方案，以期提高乳腺冷凍切片質(zhì)量，為乳腺外科術(shù)中確定手術(shù)范圍、縮短手術(shù)創(chuàng)面的暴露時間奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

1 一般資料

收集2017年1月至2017年12月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的乳腺冷凍切片標本，患者均為女性，年齡18～71歲，中位年齡48歲。

2 主要設(shè)備

LEICA CM1950冷凍切片機（德國萊卡）；PHILIPS HP8203吹風(fēng)機（飛利浦公司）。

3 試劑

包埋劑，AAF液（由95%乙醇A：乙酸A：甲醛F = 85：5∶10組成）， Harri蘇木素染液，1%鹽酸乙醇液，0.5%酸化伊紅，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，無水乙醇，二甲苯。

4 制作“帶墊”的托頭

取若干個冷凍切片機配套托頭，加上 0.2cm～0.3cm 厚的包埋劑后，置于冷凍切片機凍臺上速凍，包埋劑凍上后，用冷凍切片機將托頭上的包埋劑修平并修至余下約0.1cm厚，形成帶包埋劑墊的托頭，置于預(yù)先冷凍至-25℃的凍臺上備用。

5 冷凍切片的制備

不同取材大小條件下乳腺冷凍切片的制備：術(shù)中新鮮乳腺標本核對無誤后，書頁狀切開，在保證病理術(shù)中冷凍切片的取材工作后，避開壞死組織與脂肪組織，找到范圍較大、肉眼觀質(zhì)地一致、帶有乳腺病變的乳腺組織，每份標本在肉眼觀質(zhì)地一致的區(qū)域內(nèi)取9塊組織，取材大小分別為2cm×1.5cm×0.1cm（A組）、2cm×1.5cm×0.2cm（B組 ）、2cm×1.5cm×0.3cm（C組 ）、2cm×1.5cm×0.4cm（D組）、2cm×1.5cm×0.5cm（E組 ）、1cm×1cm×0.2cm（F組 ）、1.5cm×1.5cm×0.2cm（G組）、2cm×2cm×0.2cm（H組）、2.5cm×2cm×0.2cm（I組），取出預(yù)先制作的“帶墊”托頭，將組織塊放于托頭的包埋劑上，再加適量的包埋劑，將托頭連同組織放置于已預(yù)先冷凍至-25℃的凍臺上速凍，待乳腺組織與包埋劑剛剛凍上時，用冷凍切片機切取厚度為6μm的冷凍切片，立即放入AAF液固定30s，取出切片水洗2s，放入已預(yù)熱至45℃的蘇木素染色30s，取出切片水洗5s，1%鹽酸乙醇液分化 1～2s，溫水返藍2～5s，0.5% 酸化伊紅染 1～2s，取出切片水洗 2～5s后，依次入75%、85%、95%、無水乙醇各2s，再分別入二甲苯I、二甲苯Ⅱ各 2～5s，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。收集30例乳腺冷凍切片標本，統(tǒng)計分析不同取材大小條件下乳腺冷凍切片速凍的時間，及切片質(zhì)量中的切片完整、無皺褶、無冰晶3項指標的得分情況。

不同速凍方法下乳腺冷凍切片的制備：每份標本按B組的取材方法，切取5塊大小為2cm×1.5cm×0.2cm的乳腺組織，隨機取其中1塊組織，按B組的方法進行速凍（J組）；再隨機取其中1塊組織，立即放置于已預(yù)先冷凍至-25℃、未預(yù)先制作 0.1ml 厚包埋劑墊的托頭上，加適量的包埋劑，置于-25℃的冷凍切片機凍臺上速凍（K組）；再隨機取其中1塊組織，立即放置于常溫的托頭上，加適量的包埋劑后，置于-25℃的冷凍切片機凍臺上速凍（L組）；再隨機取其中1塊組織，室溫放置30S后，放置于常溫的托頭上，加適量的包埋劑后，置于-25℃的冷凍切片機凍臺上速凍（M組）；剩余的1塊組織于室溫放置60s后，余操作同B組進行速凍（N組）。以上5組其余操作同B組。收集30例乳腺冷凍切片標本，統(tǒng)計分析 J、K、L、M、N組5種不同速凍方法下乳腺冷凍切片速凍的時間、組織塊從托頭上崩裂下來的幾率、無冰晶指標的得分情況。

不同切片厚度下乳腺冷凍切片的制備：按B組方法進行取材、速凍，然后用冷凍切片機連續(xù)切取6張冷凍切片，厚度分別為3μm（O組）、4μm（P組）、5μm（Q組）、6μm（R組）、7μm（S組）、8μm（T組），均立即放入AAF液固定30s，余操作同B組。收集30例乳腺冷凍切片標本，統(tǒng)計分析O、P、Q、R、S、T 組6種不同切片厚度下乳腺冷凍切片的切片完整、厚度均勻適中、無皺褶3項指標的得分情況。

6 冷凍切片質(zhì)量觀察指標

切片完整（包括無脫片、無裂隙）、厚度均勻適中、無皺褶、無冰晶各10分。結(jié)果采用±s 表示。2名高級質(zhì)控師進行雙盲評片，每項指標的數(shù)據(jù)為評分的均值。

7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件對冷凍切片切片質(zhì)量各項指標的均數(shù)進行比較，采用方差分析組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 取材大小對乳腺冷凍切片的影響

A、B、C、D、E、F、G、H、I 9組乳腺組織完成速凍的時間分別為52.7±4.4s、65.3±7.8s、84.6±11.3s、122.7±15.6s、178.6±26.5s、 58.4±5.8s、61.1±4.7s、73.8±9.6s、85.3±8.2s；該 9 組切片質(zhì)量評分結(jié)果見表1。由表1可見，組織厚度＜0.2cm的A組切片完整指標得分顯著低于其余各組；組織厚度＞0.3cm的D與E組無皺褶、無冰晶2項指標的得分均顯著低于其余各組；取材面積相同的A、B、C、D、E組5組無冰晶指標的得分按A、B、C、D、E順序逐漸下降；取材厚度相同的F、G、B、H、I組5組無冰晶指標的得分按F、G、B、H、I順序略有下降?？梢?，乳腺冷凍切片取材大小以 1cm×1cm×0.2cm至2cm×1.5cm×0.3cm 為佳（圖1）。

表1 乳腺冷凍切片不同取材大小條件下3項切片質(zhì)量指標得分Tab.1 Three quality index scores of frozen sections prepared from different breast tissue sizes

2 速凍方法對乳腺冷凍切片的影響

J、K、L、M、N 組5組乳腺組織完成速凍的時間分別為 65.4±7.5s、68.7±8.9s、172.3±18.7s、174.9±14.4s、173.1±20.7s，J組與K組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；J、K 組2組完成速凍的時間顯著少于L、M、N 組3組（P均＜0.01）。J、L、M、N組4組均未發(fā)生組織塊從托頭上崩裂下來的現(xiàn)象，K組26.7%（8/30）的組織塊發(fā)生從托頭上崩裂下來的現(xiàn)象，與其他4組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。J、K、L、M、N 組5組無冰晶指標的得分分別為： 9.1±0.8、 8.9±0.9、4.6±2.4、3.7±2.2、3.1±1.6，J組與K組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；K、L、M、N 組4組無冰晶指標的得分按K、L、M、N順序逐漸下降?？梢姡A(yù)先制作“帶墊”托頭的速凍方法最佳（圖2）。

3 切片厚度對乳腺冷凍切片的影響

O、P、Q、R、S、T 組6組乳腺冷凍切片的切片完整、厚度均勻適中、無皺褶3項指標的得分情況見表2，由表2可見，O、P、Q 組3組切片完整指標的得分按O、P、Q 順序逐漸上升，Q、R 組2組切片完整指標的得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，R、S、T 組3組切片完整指標的得分按R、S、T 順序逐漸下降；O、P、Q 組3組厚度均勻適中指標的得分按O、P、Q 順序逐漸上升，Q、R 組2組厚度均勻適中指標的得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，R、S、T 組3組厚度均勻適中指標的得分按R、S、T 順序逐漸下降；O、P、Q 組3組無皺褶指標的得分按O、P、Q 順序逐漸上升，Q、R、S 組3組無皺褶指標的得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?，切片厚度以5μm及6μm最佳（圖3）。

圖1 取材大小對乳腺冷凍切片的影響。A，2cm×1.5cm×0.1cm取材大小切片不完整；B，2cm×1.5cm×0.2cm取材大小切片完整；C，2cm×1.5cm×0.4cm取材大小切片皺褶、冰晶多；D，2cm×1.5cm×0.5cm取材大小切片冰晶多；比例尺，200μmFig. 1 The effect of material size on breast frozen section. A, section was incomplete with the size of 2cm × 1.5cm × 0.1cm; B, section was complete with the size of 2cm × 1.5cm × 0.2cm; C, section had more wrinkles and ice crystals with the size of 2cm × 1.5cm × 0.4cm; D, section had more ice crystals with the size of 2cm × 1.5cm × 0.5cm; scale, 200μm

圖2 速凍方法對乳腺冷凍切片的影響。A，預(yù)先制作“帶墊”托頭的速凍方法切片冰晶少；B，未預(yù)先制作“帶墊”托頭的速凍方法切片冰晶多；比例尺，300μmFig. 2 The effect of quick freezing methods on breast tissue frozen section. A, quick freezing using pre-made “blanketed” support reduced ice crystals formation; B, quick freezing without pre-made “blanketed” support had more ice crystals formation; scale, 300μm

表2 乳腺冷凍切片不同切片厚度條件下3項切片質(zhì)量指標得分Tab. 2 Three quality index scores of frozen sections with different section thickness

圖3 切片厚度對乳腺冷凍切片的影響。A，切片厚度為3μm條件下切片不完整、厚薄不均、皺褶多；B，切片厚度為5μm條件下切片完整、厚薄均勻、皺褶少；C，切片厚度為8μm條件下切片不完整、厚薄不均、皺褶多；比例尺，100μmFig. 3 The effect of section thickness on breast frozen section. A, section was incomplete, uneven and wrinkled with a thickness of 3μm; B, section was complete, uniform, and smooth with a thickness of 5μm; C, section was incomplete, uneven and wrinkled with a thickness of 8μm; scale, 100μm

討 論

冷凍切片技術(shù)于1818 年由Pieter deRiemer 發(fā)明，直至1905 年Wilson Mecarty 將其列為病理診斷方法之一［4］。乳腺病變在外科疾病中占有相當(dāng)大的比例［5］，冷凍切片對術(shù)中制定進一步手術(shù)方案具有重要意義。

乳腺病變組織離體并及時送至病理科后，取材是影響冷凍切片質(zhì)量的首要因素，除避免標本與水接觸、避開壞死組織與脂肪組織，取材組織的大小將顯著影響冷凍切片質(zhì)量。組織小者，尤其是組織厚度＜0.2cm者，雖然速凍速度快、形成冰晶少，但組織塊太小，易出現(xiàn)部分區(qū)域已被切完、而部分區(qū)域尚未修出的現(xiàn)象，導(dǎo)致冷凍切片不完整，如果未預(yù)先制作“帶墊”的托頭，容易切到凍頭，且易影響冰剩組織常規(guī)切片的完整性，也容易造成漏診；組織塊太大，尤其是組織厚度＞0.3cm者，則速凍速度慢，冷凍后組織硬度大，加之需要加的包埋劑也較多，冷凍后硬度更大，切片時易出現(xiàn)顫痕與皺褶，且形成冰晶多，影響切片質(zhì)量。所以，在不影響診斷的前提下，乳腺冷凍切片取材大小以 1cm×1cm×0.2cm至2cm×1.5cm×0.3cm 為佳。

速凍方法是影響乳腺冷凍切片質(zhì)量的重要因素之一。作者預(yù)先制作了帶包埋劑墊的托頭，放置于預(yù)先冷凍至-25℃的凍臺上備用。乳腺組織塊取好后直接放于冷凍的包埋劑上，再進行后續(xù)速凍操作，既加快了速凍速度、減少形成冰晶，又增加了組織塊與凍頭的黏附性，避免切片時組織崩裂，也可避免組織塊太薄或過度修組織塊時切到托頭。

切片厚度也是影響乳腺冷凍切片質(zhì)量的重要因素。冷凍切片＜5μm者，常發(fā)生切片不完整、切片太薄、皺褶、裂隙；切片＞6μm者，易脫片、切片太厚，影響染色質(zhì)量，不利于鏡檢。本實驗證明，乳腺冷凍切片厚度以0.5μm～0.6μm 為佳。

本研究結(jié)果表明，通過優(yōu)化乳腺組織取材大小、速凍方法、切片厚度等條件，可顯著提高乳腺冷凍切片的制片效率與切片質(zhì)量，為術(shù)中病理診斷及手術(shù)方案的制定提供保障。