微小組織石蠟切片制作體會(huì)

梁忠泉 ，袁昌隆 ，張寶賀

（解放軍原北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院病理科，秦皇島 066100）

微小組織相對(duì)于外科手術(shù)標(biāo)本而言，一般長(zhǎng)徑小于0.3cm，如纖維支氣管鏡（纖支鏡）、電子纖維胃鏡、咽喉鏡、腸鏡等鉗取的組織，以及肺、肝、縱膈、前列腺、睪丸等穿刺吸取的組織，組織大小可為米粒大小、小米粒大小、芝麻大小，甚至為碎小組織，只要肉眼可見，長(zhǎng)徑小于0.3cm的組織，我們均稱為“微小組織”。由于微小組織體積小、質(zhì)碎、易丟失，包埋時(shí)易被熔化的石蠟液沖散、易漂浮，組織不在同一個(gè)平面上，切片時(shí)多塊微小組織不易切全、易將組織切得所剩無幾，甚至切完等。由于所獲組織大多數(shù)很微小，給病理制片帶來一定困難，因此，一些病理技術(shù)人員進(jìn)行了有益的探索，提高了制片質(zhì)量，并提出了“微小組織”的概念。但這個(gè)概念比較模糊，需要進(jìn)一步明確內(nèi)涵。本文將就“微小組織”的概念及微小組織石蠟切片的制作談一點(diǎn)體會(huì)。

材料與方法

1 微小組織標(biāo)本來源

微小組織標(biāo)本均來自我院住院和門診患者，部分來自外院送檢，主要包括內(nèi)窺鏡檢查標(biāo)本如咽喉、支氣管、胃腸、膀胱等以及針吸穿刺標(biāo)本如肺、縱膈、肝臟、腎臟、甲狀腺、胰腺、乳腺、前列腺等。

2 試劑與設(shè)備

AF固定液（95%酒精90mL，40%甲醛10mL），95%酒精，無水酒精，環(huán)保透明脫蠟液（無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司生產(chǎn)），石蠟（熔點(diǎn)56～58℃），KH-TS生物組織智能脫水機(jī)1臺(tái)，BMJ-1生物組織包埋機(jī)1臺(tái)，LEICA-RM2135切片機(jī)1臺(tái)，眼科彎鑷子等。

3 取材

微小組織送檢前用AF液固定，將送檢的微小組織用鑷子從標(biāo)本瓶中取出，放在擦鏡紙上（擦鏡紙用AF液或清水浸濕）。擦鏡紙裁剪為4.5cm×3.5cm大小，按四折疊法進(jìn)行折疊（圖1)：按接近對(duì)角線方向折疊，但不要對(duì)齊，留一定的邊緣便于包埋時(shí)打開，然后左右向中間折疊，上方向下折疊；折疊時(shí)用鑷子輕輕壓實(shí)特別是折痕處。折疊包好后，放入微孔塑料包埋盒中蓋好，然后放在生物組織智能脫水機(jī)上進(jìn)行再固定（AF液3h）、脫水(85%酒精1h、95%酒精I(xiàn) 2h、95%酒精Ⅱ 2h、無水酒精I(xiàn) 1h、無水酒精Ⅱ 2h、無水酒精Ⅲ 2h)、透明（環(huán)保透明脫蠟液I 1h、環(huán)保透明脫蠟液Ⅱ 1h）、浸蠟（蠟I1h、蠟Ⅱ 1.5h、蠟Ⅲ 1h）。若微小組織太小如碎小組織，可滴加伊紅以便識(shí)別[1]。

圖1 微小組織取材的四折疊法。按A、B、C、D的順序，均沿虛線向箭頭方向折疊，然后放入微孔塑料包埋盒E中Fig. 1 Four-step folding of microtissue. The filter paper was folded along the dotted line in the direction of the arrow in the order of A, B, C, D, which then were placed in the microporous embedding box E

4 石蠟包埋

包埋是指微小組織經(jīng)過浸蠟后，用包埋磨具、塑料包埋盒和熔化的石蠟液將微小組織包埋起來，冷卻后形成組織蠟塊[2]。方法：打開塑料包埋盒取出擦鏡紙包裹的微小組織，置包埋機(jī)操作臺(tái)熱臺(tái)上，左手持眼科彎鑷子壓住擦鏡紙邊緣，右手持眼科彎鑷子按上述折疊的相反順序打開擦鏡紙（彎鑷子應(yīng)略為加熱）（圖2），先在包埋模具中注入一半量熔化的蠟液（圖3），然后將包埋模具置于冷臺(tái)上，用略加熱的彎鑷子將微小組織轉(zhuǎn)移至包埋模具中。多塊微小組織要相對(duì)集中放置，不能重疊，用加熱的彎鑷子輕輕按壓微小組織使其在同一平面上，加蓋塑料包埋盒，表面剛有點(diǎn)蠟?zāi)r(shí)立即加注另一半熔化的蠟液（圖4）。待蠟液完全凝固后去掉包埋模具，將微小組織四周用廢舊手術(shù)刀片（大號(hào)）修切成四棱臺(tái)形狀（圖5），否則切片時(shí)易出現(xiàn)蠟帶彎曲，蠟帶不連續(xù)等情況。

圖2 包埋時(shí)按“四折疊法”的相反方向打開Fig. 2 The fi lter paper was unfolded in the opposite sequence of four-step folding method when embedded

圖3 預(yù)包埋微小組織。先往包埋模具中加入一半的熔化蠟液，然后放入微小組織Fig. 3 Pre-embed microtissues. Half of melted paraffin was first poured into the mold, and microtissues were then embedded into the melted paraffin

圖4 預(yù)包埋微小組織。蓋塑料包埋盒，加注另一半蠟液。Fig. 4 Pre-embed microtissues. A plastic cassette was placed over the mold and the rest of melted paraffin was poured into the mold

圖5 將蠟塊修切成四棱臺(tái)形狀Fig. 5 The paraffin block was trimmed into the quadrangular shape

5 切片

微小組織石蠟切片是制作優(yōu)良切片的關(guān)鍵步驟之一，應(yīng)把握好以下幾點(diǎn)：①切片前應(yīng)做好準(zhǔn)備工作，如切片機(jī)上各部位螺旋是否擰緊，切片刀的角度是否合適等。②將包埋好的微小組織蠟塊放入冰箱冷凍5min左右或放在冷凍臺(tái)上冷凍幾分鐘。③將微小組織蠟塊放在切片機(jī)的樣品夾頭內(nèi)旋緊固定好，調(diào)整好蠟塊平面，使蠟塊切面與切片刀平行，切片刀角度以20～30度為宜。④修切：修切時(shí)要手、眼、耳并用，手在轉(zhuǎn)動(dòng)快進(jìn)手輪時(shí)動(dòng)作要輕柔，快進(jìn)速度要緩慢，用力要均勻；眼要始終緊盯蠟塊表面，看組織是否露出，是否到達(dá)理想切片面；耳要注意聽聲音，未修切到組織時(shí)聲音沉悶，當(dāng)修切到組織時(shí)聲音清脆，呈“擦、擦、擦”清脆的悅耳聲，當(dāng)微小組織出現(xiàn)理想切面時(shí)開始切片。⑤切片：連續(xù)切片，轉(zhuǎn)動(dòng)切片手輪時(shí)動(dòng)作要輕柔，要?jiǎng)蛩俎D(zhuǎn)動(dòng)，切片厚度一般為3～4μm。⑥展片與黏附：將蠟帶輕輕攤于20%～40%酒精液中（溫度43℃左右），選取5～6個(gè)切面黏附于載玻片的1/3處，60℃烤片機(jī)烤片。⑥其余同常規(guī)，HE染色，根據(jù)診斷需要可進(jìn)行特殊染色、免疫組織化學(xué)染色等。

結(jié) 果

微小組織經(jīng)以上擦鏡紙折疊取材后無遺漏、丟失現(xiàn)象；石蠟包埋組織集中，無漂浮且組織位于同一平面上，組織與組織之間、組織與石蠟之間無裂隙等現(xiàn)象；切片蠟帶連續(xù)性好，幾乎無切過或切少的情況，蠟帶平整、筆直、展開良好（圖6），無明顯皺折，組織相互間距較?。▓D7），常規(guī)HE染色鏡下組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)清晰（圖8，9）。

圖6 蠟帶：經(jīng)修切的蠟塊切片蠟帶筆直Fig. 6 Paraffin strip∶ paraffin block was trimmed into straight strip

圖7 預(yù)包埋技術(shù)解決了組織不在一個(gè)平面和切不全的問題Fig. 7 Pre-embedding technique solved the problem that multiple microtissues were not in a same plane therefore avoided incomplete sectioning

討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床對(duì)術(shù)前診斷越來越重視，各種內(nèi)窺鏡早已廣泛應(yīng)用于臨床，以其定位準(zhǔn)確，對(duì)人體損傷小，病理診斷準(zhǔn)確而經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，普遍受到臨床醫(yī)生和患者的歡迎[3,4]，通過非手術(shù)途徑獲取組織標(biāo)本的數(shù)量越來越多，微小組織制片的特殊性逐步被病理技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)。筆者經(jīng)過多年的研究對(duì)微小組織的概念有了新的理解，現(xiàn)總結(jié)如下：①?gòu)膩碓纯?，微小組織不是通過手術(shù)切下來的標(biāo)本，它主要來自內(nèi)窺鏡及穿刺活檢，少量來自胸腹水、尿及各種穿刺液以及實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)離心沉淀物。②從制片流程看，微小組織需要做一些特殊處理，如取材時(shí)要進(jìn)行標(biāo)記以免因組織過小而漏掉，包埋時(shí)要進(jìn)行預(yù)包埋等。③從大小看，微小組織長(zhǎng)徑＜0.3cm，長(zhǎng)徑超過0.3cm的標(biāo)本可以和普通標(biāo)本一起無需進(jìn)行特殊處理。從以上定義可以看出，非手術(shù)來源的標(biāo)本不一定都是微小組織，偶爾有長(zhǎng)徑大于0.3cm的內(nèi)窺鏡標(biāo)本或條索狀的穿刺標(biāo)本，不需要做特殊處理，因此不能視作微小組織。

圖8 癌組織結(jié)構(gòu)和癌細(xì)胞形態(tài)清晰HE染色光鏡下觀察。比例尺，100μmFig. 8 Light microscopic view of HE stained microtissues. The structure and cell morphology of cancer tissue were clear. Scale bar, 100μm

圖9 胃體組織結(jié)構(gòu)和癌細(xì)胞形態(tài)清晰HE染色光鏡下觀察。比例尺，100μmFig. 9 Light microscopic view of HE stained microtissues of gastric body. The tissue structure and cell morphology were very clear. Scale bar, 100μm

把握好各個(gè)制片的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是解決微小組織制片難題的關(guān)鍵。臨床送檢的微小組織標(biāo)本必須進(jìn)行認(rèn)真的檢查與核對(duì)，重點(diǎn)看容器上姓名、微小組織來源等信息是否與病理申請(qǐng)單上記載一致，同一患者不同部位的標(biāo)本是否分容器盛裝，標(biāo)本固定液的量是否足夠，是什么固定液，容器是否帶蓋（如果容器不帶蓋且是95%酒精固定，一定要將固定液換成AF液或中性福爾馬林固定液，因?yàn)?5%酒精極易揮發(fā)）。如不及時(shí)取材，將導(dǎo)致微小組織標(biāo)本干涸，從而造成切片困難，難以診斷。取材時(shí)微小組織，碎小組織應(yīng)全部取材，以免遺漏，影響診斷[5]，較小組織滴加伊紅液，便于包埋時(shí)識(shí)別，夾取組織時(shí)特別小心謹(jǐn)慎，以免組織掉落。每取完一次標(biāo)本后，應(yīng)徹底清洗鑷子，以免發(fā)生交叉污染。取材包裹微小組織的材料有小紗布、小紙片、濾紙、棉襟紙、光面白紙和桑皮紙等，我們采用擦鏡紙包裹微小組織，由于滲透性好，組織固定、脫水、透明和浸蠟徹底、效果佳。包裹組織時(shí)采用上述將擦鏡紙用固定液或水浸濕和四折疊法，以及用鑷子壓實(shí)特別是折痕處等方法，保證了組織不會(huì)從擦鏡紙中“游出”，避免組織丟失和互相污染，從而保證了病理診斷的準(zhǔn)確性。

在微小組織包埋方面，我們采用了預(yù)包埋技術(shù)，即在包埋時(shí)先往包埋模具中注入一半的蠟液，置于包埋機(jī)冷臺(tái)上，然后將微小組織轉(zhuǎn)移至包埋模具中，待表面稍有蠟?zāi)r(shí)加注另一半蠟液[6]。此方法的優(yōu)點(diǎn)是：能將多塊、大小不一的微小組織較為緊湊的放置于同一平面上，且在注蠟時(shí)不會(huì)將組織沖散；由于第一次注蠟后包埋模具是置于冷臺(tái)上，模具底部溫度較低，因此會(huì)很快形成一層蠟?zāi)?；微小組織從擦鏡紙包裹中轉(zhuǎn)移至包埋模具中位置易于固定，不會(huì)發(fā)生漂浮、丟失現(xiàn)象；在轉(zhuǎn)移組織時(shí)要特別小心，注意力要集中，以防組織蹦脫。

微小組織切片較為關(guān)鍵，把握不好就會(huì)造成組織修切不全、組織切得所剩無幾，甚至將組織修切完等現(xiàn)象，特別是年輕的技術(shù)人員，由于缺乏經(jīng)驗(yàn)，易出現(xiàn)以上情況。多年來，我們采用“手、眼、耳并用”的方法，“手”掌握快進(jìn)的速度，一定要慢進(jìn)，速度要均勻；“眼”觀察組織修切的深度，當(dāng)蠟塊中心軸最大面修切到時(shí)即可連續(xù)切片，選取好的蠟帶黏附于載玻片上，一般選取5～6個(gè)切面，這樣便于病理醫(yī)生觀察不同切面的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞變化情況；“耳”聽聲音，判斷組織是否已修切到位，采用這種方法切片很好的避免和減少了微小組織切過或切少的概率，從而避免了因切片原因造成漏診。在撈片時(shí)我們?cè)谒屑尤?5%的乙醇使其濃度在20%～40%左右，這樣水的表面張力更大，蠟帶更易展開，幾乎少有皺折。

總之，由于微小組織體積小而顯得尤為珍貴，一張優(yōu)良的切片是診斷的基礎(chǔ)，因此病理技術(shù)人員必須具備高度的責(zé)任感，在平時(shí)的工作中要兢兢業(yè)業(yè)，一絲不茍，絕不可粗枝大葉，草率從事，要不斷實(shí)踐，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)要加強(qiáng)學(xué)習(xí)，要向老同志學(xué)，向書本學(xué)，有條件的要走出去學(xué)，只有不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和持續(xù)的學(xué)習(xí)，把握好微小組織制片的每一個(gè)環(huán)節(jié)，認(rèn)真對(duì)待每一張切片，把它做成精品，只有這樣才能把微小組織石蠟制片做好，才能讓病理診斷醫(yī)師、臨床醫(yī)師和患者滿意。