醇溶性和水溶性伊紅在活檢小組織標(biāo)本預(yù)染上的應(yīng)用比較

熊紅梅，卓小花，邱曉明

近年各種內(nèi)鏡及細(xì)針穿刺活檢小組織標(biāo)本越來越多，由于取材的局限性，取材組織數(shù)量少、體積小，給技術(shù)員在制片過程中帶來困難。目前國內(nèi)外對于小標(biāo)本的預(yù)處理方法不盡相同，有酸化的伊紅液[1]、未酸化的伊紅液、伊紅-固定液[2]等預(yù)染法，均采用水溶性伊紅配成的各種預(yù)染液。由于試劑配置方法、劑量等均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，采用常規(guī)的伊紅滴染法效果不佳。為了增加組織的肉眼識(shí)別度，提高包埋、切片的速度和質(zhì)量，筆者在日常外檢工作中采用醇溶性伊紅在脫水中對活檢小標(biāo)本進(jìn)行預(yù)染，取得滿意效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1月福建省龍巖市第一醫(yī)院病理科胃腸鏡、陰道鏡活檢標(biāo)本及肺、乳腺、前列腺穿刺組織標(biāo)本合計(jì)200例，直徑均小于0.3 cm，隨機(jī)分成2組：水溶性伊紅預(yù)染法組、醇溶性伊紅預(yù)染法制作組，每組各100例。標(biāo)本取材均使用相同規(guī)格的正方形包埋紙，應(yīng)用相同的折疊方式包裹組織防止漏檢，兩組均用櫻花Vip5脫水機(jī)，常規(guī)固定、脫水、透明，水溶性及醇溶性伊紅粉劑購自上海試劑三廠。

1.2 試劑0.5%水溶性伊紅配置：0.5 g水溶性伊紅溶于100 mL蒸餾水。0.05%醇溶性伊紅配置：1.75 g醇溶性伊紅溶于脫水機(jī)第1道3 500 mL無水乙醇中。

1.3 方法(1)水溶性伊紅預(yù)染法：取材時(shí)用0.5%水溶性伊紅滴1～2滴于每一例組織上，再用包埋紙包好后放入包埋盒，入脫水機(jī)處理。(2)醇溶性伊紅預(yù)染法：取材時(shí)不滴染伊紅，直接包埋紙包好放入包埋盒，入脫水機(jī)處理，在換脫水液時(shí)在第1道3 500 mL無水乙醇中加入1.75 g醇溶性伊紅，稍攪伴溶解均勻，直到下一次更換脫水液時(shí)為止。本科室每天檢測150～200個(gè)活檢小標(biāo)本，使用1個(gè)月，中間無需添加伊紅。兩種方法均使用相同機(jī)器和流程，脫水時(shí)間12 h，比較組織的肉眼識(shí)別度及鏡下HE染色結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定根據(jù)蠟塊組織標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評判[2]，包埋時(shí)肉眼觀察活檢小組織：鮮紅色為()，淡紅色為(+)，極微弱紅色或完全不著色為(-)。鏡下評判標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊》進(jìn)行染色評判。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法在脫水后的組織著色對比水溶性伊紅滴染的胃腸鏡活檢標(biāo)本及陰道鏡子宮頸活檢標(biāo)本均有不同程度的褪色，包埋時(shí)呈淡紅色，穿刺組織呈微弱或完全不著色，包埋后組織與石蠟對比不明顯，識(shí)別度較低。醇溶性伊紅預(yù)染法各種活檢小標(biāo)本均呈鮮紅色，包埋時(shí)組織與石蠟對比鮮明，明顯優(yōu)于水溶性伊紅滴染法(P<0.001，表1，圖1～6)。

圖1 水溶性伊紅預(yù)染法：穿刺組織，不著色 圖2 醇溶性伊紅預(yù)染法：穿刺組織，鮮紅色 圖3 水溶性伊紅預(yù)染法：胃組織，不著色 圖4 醇溶性伊紅預(yù)染法：胃組織，鮮紅色 圖5 水溶性伊紅預(yù)染法：子宮頸組織，微弱紅色 圖6 醇溶性伊紅預(yù)染法：子宮頸組織，鮮紅色 圖7 水溶性伊紅預(yù)染法：胃組織，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，紅細(xì)胞呈鮮紅色 圖8 醇溶性伊紅預(yù)染法：胃組織，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，紅細(xì)胞呈鮮紅色

表1 兩種方法脫水后的組織著色對比

2.2 兩種方法組織結(jié)構(gòu)對比鏡下觀察兩種方法制作切片的HE染色，結(jié)果顯示組織均結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，紅細(xì)胞呈鮮紅色，對比清晰，染色效果無明顯差異(圖7、8)。

3 討論

臨床病理工作中，取材醫(yī)師肉眼觀察活檢小標(biāo)本直徑為0.01～0.2 cm，呈點(diǎn)狀或米粒狀。穿刺組織呈條索狀，由于體積小，標(biāo)本又極其珍貴，若預(yù)染不當(dāng)，包埋時(shí)組織與石蠟顏色相近，不易識(shí)別，易造成遺漏或丟失現(xiàn)象。常規(guī)方法在取材時(shí)逐個(gè)滴染水溶性伊紅，組織經(jīng)脫水機(jī)第一缸10%中性福爾馬林固定及梯度乙醇脫水后均有不同程度脫色，導(dǎo)致包埋時(shí)顏色淡或不著色。由于伊紅是酸性染料，組織成分的等電點(diǎn)3.3～5.2，著色后的組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，pH>5.0，伊紅的結(jié)合能力下降，染液結(jié)合牢度減弱，在乙醇脫水過程中易快速褪色[3]。醇溶性伊紅預(yù)染法將組織浸泡在脫水的第1道無水乙醇中30 min，再經(jīng)二道無水乙醇脫水。因此醇溶性伊紅預(yù)染法與水溶性伊紅預(yù)染法相比，其優(yōu)點(diǎn)如下：(1)易識(shí)別、醒目，提高包埋、切片的速度與質(zhì)量，不致于過切或少切，提高制片效率。水溶性伊紅預(yù)染法屬于滴染法，醇溶性伊紅預(yù)染法屬于浸染法，有學(xué)者研究使用水溶性伊紅的浸染固定法與滴染法之間著色差異無顯著性[4]，但浸染法與滴染法的制片時(shí)間差異有顯著性[4]。醇溶性伊紅預(yù)染法是將醇溶性伊紅加入無水乙醇中，不易脫色。伊紅浸染固定法是將水溶性伊紅加入10%中性福爾馬林，將組織浸泡在含伊紅的固定液中固定，再經(jīng)后續(xù)的各級濃度乙醇脫水后，乙醇會(huì)使已染上伊紅的組織不同程度脫色，此水溶性伊紅浸染固定法與水溶性伊紅滴染法著色無顯著性，醇溶性伊紅浸染法與水溶性伊紅滴染法著色差異有顯著性。(2)節(jié)省試劑用量及配制時(shí)間，水溶性伊紅預(yù)染法所需的伊紅試劑多、濃度高，配制較麻煩，醇溶性伊紅預(yù)染法無需另外配制，只需在脫水無水乙醇試劑內(nèi)按0.05%濃度直接加入醇溶性伊紅粉劑，試劑用量少，配制簡單。(3)縮短取材時(shí)間，減少工作流程，提高工作效率。無論是不同酸類酸化或未酸化水溶性伊紅滴染法[1]或蘇木精滴染法[4]，取材時(shí)每例均滴上1～2滴預(yù)染液，耗時(shí)，影響取材速度，對于活檢小標(biāo)本工作量大的單位尤其不適用。盡管有些學(xué)者用0.4%伊紅-福爾馬林固定液[2]或0.15%蘇木精-福爾馬林固定液[4]對活檢小標(biāo)本浸染固定法均能獲取良好的效果，但需增加浸染的時(shí)間和流程。醇溶性伊紅預(yù)染法無需額外增加時(shí)間和工作流程，在脫水中預(yù)染，明顯提高工作效率。(4)脫水機(jī)堵管：丁偉等[3]報(bào)道將伊紅加入95%或無水乙醇中，使用時(shí)間久后，可能會(huì)引起伊紅在脫水機(jī)管路中沉淀、累積，導(dǎo)致機(jī)器堵塞，筆者經(jīng)2年實(shí)踐，將醇溶性伊紅加入無水乙醇中并未發(fā)現(xiàn)堵管現(xiàn)象。按本科室每天150～200個(gè)蠟塊工作量，使用1個(gè)月后更換脫水試劑時(shí)用乙醇計(jì)測得第1道無水乙醇濃度降為96%，第1道95%乙醇濃度降為80%，第2道95%乙醇濃度降為90%。第1道無水乙醇濃度降為96%能使0.05%醇溶性伊紅徹底溶解，缸底未發(fā)現(xiàn)有伊紅沉淀現(xiàn)象。如果將醇溶性伊紅加入脫水的第1道或第2道95%乙醇，會(huì)出現(xiàn)少許沉淀現(xiàn)象。文獻(xiàn)報(bào)道[5]將少許伊紅加入80%脫水乙醇中使活檢小標(biāo)本染上伊紅色，由于醇溶性伊紅在低濃度乙醇中溶解度低，隨著脫水液使用周期延長，乙醇濃度下降易導(dǎo)致堵管現(xiàn)象的發(fā)生。因此，為防止脫水機(jī)故障，將伊紅加在第1道無水乙醇中為佳。

總之，用酸化伊紅液滴染[1]、蘇木精滴染、蘇木精浸染固定法[4]進(jìn)行預(yù)染，均取得良好效果。本科室使用醇溶性伊紅預(yù)染法切片顏色鮮艷，效果穩(wěn)定，非常方便，值得臨床推廣應(yīng)用。