RP—HPLC法測(cè)定亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）的含量均勻度

陳向丹 王峻 萬(wàn)珊 董書(shū)香 丁陽(yáng)

摘 要：目的：建立RP-HPLC法測(cè)定亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）的含量及其含量均勻度方法。方法：采用Agilent Eclipse Plus C18（15cm×4.6mm，5um）色譜柱，以0.015mol/L磷酸二氫鈉溶液-甲醇（70∶30）為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。結(jié)果：在5～250μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積與對(duì)照品濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，r=0.9998；回收率為100.2% （n=30）。結(jié)論：該法快速、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可用于亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：亞硫酸氫鈉甲萘醌粉；含量均勻度；RP-HPLC法

中圖分類(lèi)號(hào) R927 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）20-0035-3

Determination of the Content Uniformity of Menadione Sodium Bisulfite Powder （Aquaculture） - RP-HPLC Method

Chen Xiangdan et al.

（Hubei Institute for Veterinary Drug，Wuhan 430070，China）

Abstract：Purpose：To determine the content and content uniformity of Sodium Bisulfite naphthone quinone powder （aquaculture） by RP-HPLC. Methods： Agilent Eclipse Plus C18 （15cmx4.6mm， 5 um） column， with 0.015mol/L sodium dihydrogen phosphate methanol （70∶30） as the mobile phase， the flow rate of 1.0mL/min， the detection wavelength of 230nm. Results： In the range of 5 ～250μg/mL， the chromatographic peak area has a good linear relationship with the concentration of the control product， R =0.9998， and the recovery rate is 100.2% （n = 30）. Conclusion： The method is fast， simple and reproducible， and can be used for the quality control of Menadione Sodium Bisulfite powder （aquaculture）.

Key words：Menadione Sodium Bisulfite powder ；Content uniformity；RP-HPLC

亞硫酸氫鈉甲萘醌為維生素類(lèi)藥物，主要作用為阻塞型黃疸、膽瘺、慢性腹瀉，在動(dòng)物肝臟內(nèi)參與凝血酶的合成，促進(jìn)凝血酶原的形成，加速凝血，維持正常的凝血時(shí)間，一般用于輔助治療魚(yú)、鰻、鱉等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的出血、敗血癥[1]。《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版化學(xué)藥品卷收載的亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用），其含量測(cè)定為提取甲萘醌后采用紫外分光光度法[2]。但由于亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）規(guī)格為1%，需測(cè)定含量的均勻度，上述方法較為繁雜，重現(xiàn)性和精密度都相對(duì)不高，不適用于含量均勻度測(cè)定。為此，本研究開(kāi)展了高效液相色譜測(cè)定亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）的含量均勻度的方法的探索。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備 島津20AD高效液相色譜儀；Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，4.6×150mm（i.d.），粒徑 5μm；Mettler AE240 電子天平；MILIPORE 超純水處理器等。

1.2 試劑與耗材 1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）樣品為：（1）湖北武當(dāng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：140301；（2）湖北農(nóng)科生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150101；（3）湖南五指峰生化有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150601。甲萘醌對(duì)照品：購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量為99.3%，批號(hào)：10029-0008；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑為優(yōu)級(jí)純。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，4.6×150mm，5μm）；流動(dòng)相：0.15mol/L磷酸二氫鈉溶液-甲醇（70∶30，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.8）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；理論板數(shù)及分離度均應(yīng)符合規(guī)定。

2.2 溶液的制備 避光操作。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取甲萘醌對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置100mL量瓶中，用5mL甲醇溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液5mL，振搖1min，加水稀釋至刻度，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品約0.5g，精密稱(chēng)定（約相當(dāng)于亞硫酸氫鈉甲萘醌5mg），置200mL量瓶中，加水適量，振搖使亞硫酸氫鈉甲萘醌溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液1mL，并用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.3 含量及含量均勻度測(cè)定法 精密稱(chēng)取供試品10份按2.2.2方法制備供試品溶液，避光操作，按2.1項(xiàng)下的色譜條件試驗(yàn)。精密量對(duì)照品溶液及供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果與1.918相乘，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性 按2.1項(xiàng)下的色譜條件試驗(yàn)，分別量取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白對(duì)照溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白輔料在亞硫酸氫鈉甲萘醌峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

2.4.2 線(xiàn)性 精密稱(chēng)取亞硫酸氫鈉甲萘醌原料100mg，置200mL量瓶中，加水適量，振搖使亞硫酸氫鈉甲萘醌溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液1mL，并用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取貯備液適量，用水分別稀釋至亞硫酸氫鈉甲萘醌濃度為5、10、25、50、100、250μg/mL的溶液，各取20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（mV）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸（結(jié)果見(jiàn)圖4），得回歸方程：Y=56624X-5531.4，r=0.9998?？梢?jiàn)在此色譜條件下亞硫酸氫鈉甲萘醌在5～250μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（甲萘醌10μg/mL），按2.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得甲萘醌峰面積平均值為1396746，RSD為0.5%。

2.4.4 回收率試驗(yàn) 按處方比例配制1%的亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，分別精密稱(chēng)取約16mg、20mg和24mg的亞硫酸氫鈉甲萘醌原料及約2g的輔料置200mL具塞容量瓶中，按2.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定（進(jìn)樣量改為5μL），按外標(biāo)法計(jì)算亞硫酸氫鈉甲萘醌的含量，計(jì)算回收率（測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1）。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（甲萘醌10μg/mL），按2.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，室溫下，在不同時(shí)間（0，2，4，6，8，10，12h）分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得甲萘醌峰面積平均值為1420088，RSD為0.7%，表明供試品溶液在室溫下放置12h穩(wěn)定。

2.4.6 1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）樣品的含量測(cè)定 分別取同一廠(chǎng)家不同批號(hào)的樣品，采用2.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定含量及含量均勻度，結(jié)果均符合規(guī)定。樣品含量測(cè)定結(jié)果如表2。

3 討論與結(jié)論

（1）檢測(cè)波長(zhǎng)的確定：取上述用亞硫酸氫鈉甲萘醌原料制成的對(duì)照溶液、甲萘醌對(duì)照品制成的對(duì)照溶液和供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，以DAD檢測(cè)器在200～400nm波長(zhǎng)處記錄色譜圖，作峰純度檢査，其色譜圖中的主峰為一純物質(zhì)峰。峰純度檢査的高效液相光譜圖譜顯示，亞硫酸氫鈉甲蔡醌在230nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇230nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度較高[3]。

（2）由于亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）為規(guī)格小于2%的粉劑，按目前標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法測(cè)定含量均勻度存在諸多影響結(jié)果準(zhǔn)確的因素，本文采用反相高效液相色譜法測(cè)定含量均勻度，具有簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，極大地提高了工作效率，并節(jié)約了人力物力，能準(zhǔn)確反映1%規(guī)格亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（水產(chǎn)用）的含量及含量均勻度，可用于該制劑含量及含量均勻度測(cè)定的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)獸藥典委員會(huì).《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版（化學(xué)藥品卷）[S].

[2]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二○一五年版一部[S].

[3]張偉，程輝躍，金竹，等.HPLC法測(cè)定亞硫酸氫鈉甲萘醌片的含量[J].藥物分析雜志，2005，25（12）：1567-1569.

（責(zé)編：張宏民）