不同pH條件下五倍子中EGCG，EGC，ECG含量測定及分析

周紅超+陳平+張建博+左曉霜+華杰+范源

摘要：目的測定不同pH條件下的五倍子中EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、EGC（表沒食子兒茶素）、ECG（表兒茶素沒食子酸酯）的含量變化。方法應用反向高效液相色譜法，測定在超聲1h條件下五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸緩沖液（pH值分別為2、3、4、5、6、7、8）中的含量變化情況。結果EGCG在緩沖液pH值為2～5和6～8區(qū)間呈上升趨勢，pH值為5～6區(qū)間呈下降趨勢，且在pH值為8時含量最高；EGC在緩沖液pH值為2～4和7～8區(qū)間呈下降趨勢，pH值為4～7區(qū)間呈上升趨勢，且在pH為2時含量最高；ECG在緩沖液pH值為2～3和4～5區(qū)間呈下降趨勢，pH值為3～4和5～8區(qū)間呈上升趨勢，且在pH值為8時含量最高。結論五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH值條件下的含量有變化，反映了酸堿度對五倍子中EGCG，EGC，ECG含量變化的影響，本實驗研究可為五倍子的理化性質研究以及質控標準等方面提供一定的參考。

關鍵詞：RP-HPLC法；五倍子粉；EGCG；ECG；EGC；含量變化

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2016）09-0078-03

五倍子是癭綿蚜科（Pemphigidae）五節(jié)根蚜亞科（Fordinae）某些蚜蟲寄蟲癭。五倍子別名文蛤，百蟲倉，木附子等，是生在漆樹科（Anacadiaceae）鹽膚木屬（Rhus L）幾種樹的復葉上形成的一類商品，五倍子有角倍類，肚倍類，花倍類。始載于《開寶本草》，具有斂肺降火，澀腸止瀉，固精縮尿，止汗，止血，解毒，斂瘡等多種臨床功效，以它為原料的各種產品廣泛應用于醫(yī)藥，冶金，食品航天等領域[1-3]。

五倍子主要有效成分為鞣質，又稱鞣酸。因五倍子盛產于我國，國際上又將五倍子鞣質稱為中國鞣質，它是倍酰葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羥基與沒食子酸所形成的酯類化臺物的混合物，屬可水解鞣質[4]。五倍子的鞣質含量很高，最高可達70%以上。1994年林余霖等[5]測定了7種五倍子中單寧酸的含量，角倍為4901%，肚倍為6475%圓角倍為6075%，其他幾種均在40%左右。沒食子酸也是五倍子中主要成分之一，在制藥等工業(yè)上應用廣泛，也是藥物中間體，它的含量約占五倍子2%一4%[6]。由于含量小，工業(yè)上從五倍子獲取的沒食子酸主要通過五倍子鞣質的水解獲得，它是我國的出口產品之一。五倍子中還含有五倍子油。五倍子油的主要化學成分為癸酸、月桂酸、內豆蔻酸、棕櫚酸、硬腰酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等8種；五倍子中含有多種微量元素，包括銅、鋅、鐵、鎂、鈉、鈣等的化合物；此外，五倍子中還有樹脂、脂肪物質、淀粉、蠟質、蛋白質等其他成分。

五倍子中化學成分現(xiàn)已成為研究熱點，李春遠等[7]對五倍子的石油醚和氯仿提取物做了分離，一共獲得10個化合物，分別為2-羥基-6-十五烷基苯甲酸、白果酚、棕櫚酸-1，3-二甘油酯、β-谷甾醇、正二十五烷、3-甲氧基-4-羥基-苯甲酸、棕櫚酸、月桂酸、肉豆蔻酸、沒食子酸。而五倍子中EGCG，EGC，ECG報道較少。EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯），是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體，是茶多酚生物活性的主要成份。純品為白色粉末，味苦澀、無毒、極易溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯，不溶于氯仿。熔點218℃，在空氣中易被氧化，變成微粉色，也容易隨著溫度的升高而被氧化。EGCG中含多個酚羥基，具有很強的抗氧化和清除自由基的能力[8]。EGC（表沒食子兒茶素），別名：表沒食子酸兒茶素；綠茶兒茶酚；L-表沒食子兒茶精等。熔點208-210℃。儲存溫度2-8℃。EGC中的多酚結構與其抗氧化或促氧化作有關[9-10]。ECG（表兒茶素沒食子酸酯）。分子式：C22H18O10。分子量44237[11-12]。純品為白色粉末。儲存溫度2-8℃。酯型兒茶素ECG具有極強的抑菌活性，可能開發(fā)成一種天然的類抗生素物質[14]。本實驗依據(jù)EGCG，EGC，ECG的理化性質，應用RP-HPLC測定在不同pH條件下五倍子中EGCG，EGC，ECG的含量變化。

結構式：

1實驗材料與儀器

11實驗藥品五倍子（角倍，購自昆明道地中藥飲片廠 規(guī)格：飲片 批號：130801）；EGCG（道斯夫生物479-560-7）；ECG（中國藥品生物制品檢定所 1257-08-05）；EGC（上海銳谷生物科技有限公司970-74-1）。

12儀器與試劑高效液相色譜儀（Agilent1200 型 VWD檢測器）；Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）。萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司制造）；精密pH測定儀（上海雷磁 PHS-3C型）；循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠 SHZ-DIII型）；高速多功能粉碎機（YB-500A型）；80目篩（5號篩180μm）；電熱恒溫干燥箱（DHG-9071A型）；超聲儀（KUDOS型）；移液管；燒杯；玻璃棒；容量瓶；微孔濾膜（045μm）；注射器（1mL）；無水甲醇（色譜純）；無水乙醇（分析純）；磷酸（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；冰醋酸（分析純）；純化水。

2實驗方法

21磷酸鹽緩沖液的配制A液：取磷酸10 mL，加純化水至100 mL，搖勻。B液：稱取磷酸氫二鈉7163 g，加純化水使溶解成100 mL。分別取上述不同體積的A 液和B液混合配制成不同pH（2、3、4、5、6、7、8）的磷酸鹽緩沖溶液，即得。

22對照品溶液的制備取EGCG標準品適量，于分析天平上精密稱定，稱得29 mg；取ECG標準品適量，于分析天平上精密稱定，稱得3 mg；取EGC標準品適量，于分析天平上精密稱定，稱得27 mg。分別置于10 mL容量瓶中，加純凈水定容至10 mL。在超聲儀中超聲溶解，通過045 μm濾膜注射至進樣瓶并編號，即得。

23供試品溶液的制備取五倍子樣品適量，敲開囊體，去除蚜蟲尸體和蚜蟲排泄物，用粉碎機粉碎，過80目篩，于電子天平上分別稱取10 g五倍子粉末7份，置于試管中并編號（2，3，4，5，6，7，8），分別加入磷酸鹽緩沖液（編號與pH值對應）20 mL，在超聲儀中超聲1h，用045 μm微孔濾膜抽濾，用1 mL注射器吸取適量對照品溶液，通過濾膜注射至進樣瓶并編號，即得。

24色譜條件色譜條件為：Agilent C18色譜柱C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇：水：冰醋酸（25：74：1）混合液；溫度25℃；流速：1 mL/min；波長270nm；進樣量：10 uL；時間：30 min[14]。

25標準曲線的繪制

251EGCG標準曲線的繪制取EGCG適量于分析天平上精密稱定360 mg，加色譜甲醇溶解配制成定容至10mL，用1 mL注射器吸取適量，通過045 μm微孔濾膜注入進樣瓶，按上述EGCG色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面積（Y）對標準品質量（X）進行線性回歸，得方程Y=1387X+5172，r=1，結果表明：EGCG峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為：072μg-432 μg。

252EGC標準曲線的繪制取EGC適量于分析天平上精密稱定300 mg，加色譜甲醇溶解配制成定容至10 mL，用1 mL注射器吸取適量，通過045 μm微孔濾膜注入進樣瓶，按上述EGCG色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，以EGC的峰面積（Y）對標準品質量（X）進行線性回歸，得方程Y=3573X+1019，r=09991，結果表明：EGC峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為：06 μg-36 μg。

253ECG標準曲線的繪制取ECG適量于分析天平上精密稱定600 mg，加色譜甲醇溶解配制成定容至10 mL，用1 mL注射器吸取適量，通過045 μm微孔濾膜注入進樣瓶，按上述ECG色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面積（Y）對標準品質量（X）進行線性回歸，得方程Y=1615X-1000，r=09996，結果表明：EGCG峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為：12 μg-72 μg。

26EGCG，EGC，ECG的含量測定分別取23項下方法制備的供試品溶液適量，按24色譜條件分別測定EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸鹽緩沖液條件下的含量，用標準曲線法進行計算。

3實驗結果與分析

31不同pH條件下EGCG，EGC，ECG 的含量變化

在緩沖液pH值為2～3的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量急劇下降；pH值為3～5的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量變化不明顯；pH值為5～7的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量逐漸增加；pH值為7～8的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量緩慢下降，且當pH值為2時，在所測pH值范圍中含量達到最高。如圖2

在緩沖液pH為2～3的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量緩慢下降；pH值為3～4的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量緩慢增加；pH值為4～5的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量逐漸減少；pH值為5～6的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量逐漸增加，且當pH值為8時，在所測pH值范圍中含量達到最高。如圖3

EGC在pH值為2～3的區(qū)間呈明顯下降趨勢，在pH值為2時含量最高，但酸性強則EGCg，ECG含量較低，當pH值為7時，含量較高且酸堿度在中性；EGCG和ECG在pH值為5～8的區(qū)間呈上升趨勢，且在pH值為8時兩者含量都達所測范圍的最高，酸堿度偏中性；在pH值為6～8的區(qū)間，EGCG，EGC，ECG含量都呈上升趨勢，可能是由于偏堿、超聲條件使其提取率增加，還需要做更深一步的研究。

4結論

五倍子中EGCG，EGC，ECG報道較少。通過測定EGCG，EGC，ECG在不同pH緩沖液中的含量，結果提示：五倍子在pH值為8的緩沖液中EGCG含量最高；五倍子在pH值為2的緩沖液中EGC含量最高；五倍子在pH值為8的緩沖液中ECG含量最高。本實驗可以為五倍子進一步的理化性質研究以及質控標準等方面提供一定參考。參考文獻：

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