萹蓄配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究

高穎+張云天

摘 要：目的是采用HPLC法建立萹蓄配方顆粒的指紋圖譜分析方法。采用HPLC法，以Megres5-C18（Hanbon，250 mm× 4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫；檢測波長為0～15 min，260 nm，15～65 min，350 nm；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。結(jié)果表明，構(gòu)建的指紋圖譜共有7個共有峰，各批次萹蓄配方顆粒樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均在0.95以上，可用于萹蓄配方顆粒的定性鑒別。結(jié)論是，建立的指紋圖譜重現(xiàn)性好，可為提高萹蓄配方顆粒的質(zhì)量控制提供有益的信息。

關(guān)鍵詞：萹蓄配方顆粒；HPLC法；指紋圖譜；特征峰

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2015.15.013

文章編號：2095-6835（2015）15-0013-02

萹蓄為蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，具有利尿通淋、殺蟲止癢的功效，臨床多用于治療泌尿系統(tǒng)感染、非胰島素依賴性糖尿病、細(xì)菌性痢疾、結(jié)石和腎炎等疾病。據(jù)文獻(xiàn)報道，黃酮類成分是萹蓄抗菌消炎的主要活性成分。萹蓄配方顆粒是由萹蓄飲片加工制成的，具有免煎易服、易儲存和使用方便等優(yōu)點。傳統(tǒng)的質(zhì)量控制指標(biāo)單一，難以反映萹蓄配方顆粒的真實質(zhì)量。鑒于此，本文采用HPLC法建立萹蓄配方顆粒的指紋圖譜，實現(xiàn)從整體上控制萹蓄配方顆粒質(zhì)量的目的，為更有效地控制萹蓄配方顆粒質(zhì)量提供科學(xué)的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent-G1311C四元泵、Agilent-G1329B進(jìn)樣器、Agilent-G1315D DAD檢測器、CHEMSTATION B.04.02化學(xué)工作站和超聲波清洗器（無錫超聲電子設(shè)備公司）。

1.1.2 試劑和藥材

萹蓄配方顆粒是由江陰天江藥業(yè)有限公司提供的，沒食子酸對照品（編號111083-201204）購于中國藥品生物檢定所，楊梅苷對照品（編號111860-201101）購于中國食品藥品檢定所，槲皮苷對照品（編號111538-200504）購于中國藥品生物檢定所，槲皮素對照品（編號100081-200907）購于中國食品藥品檢定所，山奈素對照品（編號110861-200808）購于中國食品藥品檢定所。乙腈為色譜純（上海振興化工一廠），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含57.6 μg的溶液，即得；精密稱取楊梅苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含58.7 μg的溶液，即得；精密稱取槲皮苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含123.0 μg的溶液，即得；精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含65.0 μg的溶液，即得；精密稱取山奈素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含22.0 μg的溶液，即得。

1.2.2 供試品溶液的制備

取萹蓄配方顆粒0.5 g置具塞錐形瓶中，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率200 W，

頻率40 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，離心，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 色譜條件

Megres5-C18（Hanbon，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相以乙腈為流動相A，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸水溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 萹蓄配方顆粒特征圖譜梯度洗脫表

檢測波長為0～15 min，260 nm，15～65 min，350 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。在此色譜條件下，對照品和樣品中各色譜峰均獲得了較好的分離。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，以3號峰楊梅苷為參照峰，考察7個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%.結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗

取同一批萹蓄配方顆粒（批號：1207019），按1.2.3項下制備方法平行操作，制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL分析。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對保留時間及其相對峰面積的RSD均小于3%.這表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，以3號峰楊梅苷為參照峰，考察7個共有峰指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%. 結(jié)果表明，供試品溶液放置24 h，其穩(wěn)定性良好。

2.4 建立指紋圖譜

2.4.1 確定特征峰

采用相對保留時間標(biāo)定共有峰，以楊梅苷為參照峰（S），將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照峰的保留時間相比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間。分別計算10批樣品特征圖

譜中各色譜峰的相對保留時間和峰面積，篩選出7個共有峰，如圖1所示，其特征峰的相對保留時間為0.29（峰1）、0.70（峰2）、1.00（峰3）、1.17（峰4）、1.19（峰5）、1.45（峰6）和1.54（峰7）。峰1為沒食子酸，峰3為楊梅苷，將其作為S峰，峰5為槲皮苷，峰6為槲皮素，峰7為山奈素。

圖1 10批萹蓄配方顆粒的共有特征峰

2.4.2 特征圖譜相似度評價

將所得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入采用藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”中，設(shè)定參照圖譜，采用多點校正將色譜峰自動匹配，然后生成對照圖譜進(jìn)行相似度評價。結(jié)果表明，10批樣品的相似度均在0.95以上，說明這10批萹蓄配方顆粒的差別很小，質(zhì)量比較穩(wěn)定。

3 分析結(jié)果討論

該實驗構(gòu)建了萹蓄配方顆粒HPLC指紋圖譜，以楊梅苷為參照峰確定了7個共有峰，各峰的保留時間匹配比較好，其相對保留時間RSD均小于3%.利用相似度軟件計統(tǒng)計江陰天江藥業(yè)10批萹蓄配方顆粒樣品，對照圖譜和各批樣品之間的相似度比較好，不同批次萹蓄配方顆粒指紋圖譜的色譜峰整體基本一致，具有專屬性，為有效控制萹蓄配方顆粒質(zhì)量提供了科學(xué)的方法。

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〔編輯：白潔〕