基于高分離度和高色譜峰純度的紅參UPLC指紋圖譜研究

馮偉紅+李春+吉麗娜+楊立新+榮立新+陳兩綿+易紅+王智民

[摘要]采用UPLC建立紅參指紋圖譜。采用Waters Acquity BEH C₁₈（ 2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）色譜柱進行分離，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，檢測波長203 nm。通過對22批紅參進行測定，建立了紅參的UPLC指紋圖譜，并定義了26個共有峰。采用對照品比對，指認了其中的11個共有峰，它們分別是人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh₁、人參皂苷Rg₂、人參皂苷Rb₁、20（S）-人參皂苷F1、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、20（S）-人參皂苷Rg₃、20（R）-人參皂苷Rg₃。其中的20（S）-人參皂苷Rg₃和20（R）-人參皂苷Rg₃這一組差向異構體是紅參的特征成分，它們不僅可以用于區(qū)分紅參與人參，同時也可用于紅參炮制的過程控制。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對22批紅參UPLC指紋圖譜進行了相似度評價，結果 18批樣品的相似度大于0.9。與文獻報道的紅參指紋圖譜測定方法比較，該研究所建立的方法具有高效、專屬性強、分離度高、色譜峰純度高、方法簡單易行的特點，可用于人參類藥材的品種鑒定和質(zhì)量控制，并為上述藥材質(zhì)量標準的提升提供了理論依據(jù)。

[關鍵詞]UPLC； 紅參； 人參皂苷； 指紋圖譜； 高分離度； 高色譜峰純度

[Abstract]This study is to establish the UPLC fingerprint of red ginseng. The separation was performed on a Waters Acquity BEH C₁₈ column （2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）， with the mobile phase consisting of acetonitrile and water for gradient elution. The detection wavelength was set at 203 nm. The UPLC fingerprint of red ginseng was established by using sample chromatography of 22 different purchase areas and 26 common peaks were found. Compared with the reference substances， 11 of the common peaks were identified as ginsenosides Rg₁， ginsenoside Re， ginsenoside Rf， ginsenoside Rh₁， ginsenoside Rg₂， ginsenoside Rb₁， 20（S）-ginsenoside F₁， ginsenoside Rb₂， ginsenoside Rb₃， 20（S）-ginsenoside Rg₃ and 20（R）-ginsenoside Rg₃， respectively. It is worth noting that 20（S）-ginsenoside Rg₃ and 20（R）-ginsenoside Rg₃ are the characteristic ingredients of red ginseng， and they could be used not only for distinguishing red ginseng and ginseng， but also for process controlling of the preparation of red ginseng. The similarity was analyzed with′ Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Materia Medica， and the similarity of 18 batches samples is up to 0.9. Compared to the literature methods， the method is simple， time-saving，specific for the separation of ginsenosides from red ginseng. So， this method could be used for the species identification and quality control of ginseng， red ginseng and American ginseng， and it will alsoprovide a theoretical basis of raising quality standards of the above mentioned Chinese herb medicines.

[Key words]UPLC； red ginseng； ginsenosides； fingerprint chromatogram； good separation； good purity

doi：10.4268/cjcmm20162015

紅參為五加科植物人參Panax ginseng C. A. Meyer的干燥根及根莖經(jīng)蒸制后的干燥品。具有大補元氣，復脈固脫，益氣攝血的作用，用于體虛欲脫，肢冷脈微，氣不攝血，崩漏下血^[1]。

長期以來，紅參的質(zhì)量評價方法與人參和西洋參類似，均以人參皂苷類成分為檢測指標，2015年版《中國藥典》中人參、紅參和西洋參的質(zhì)量控制依然是采用HPLC方法^[1]，僅僅測定藥材中人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re和人參皂苷Rb₁這3個主要成分的含量，人參和紅參分別以含人參皂苷Rg₁和人參皂苷Re的總量分別不得低于0.3%和0.25%，人參皂苷Rb₁均不得低于0.2%加以控制，而西洋參則以這3種人參皂苷的總量不得低于2.0%進行質(zhì)量控制。這種法定標準顯然遠遠落后于行業(yè)發(fā)展的需求。

近年來，文獻已報道的對人參、紅參和西洋參的質(zhì)量評價主要從多成分含量測定研究^[2-12]和指紋圖譜研究^[13-29]2個方面進行。多成分含量測定研究通常同步測定人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃和人參皂苷Rd這7個成分，一般情況下，雖然西洋參的含測增加了特征性成分擬人參皂苷F11^[14]，人參增加了標志性成分人參皂苷Rf^[2-7]，紅參增加了特征性成分人參皂苷Rg₃^[8-10]，但因為也僅僅是測定有限的幾個主要成分，因此仍不能反映這些藥材中皂苷類成分的概貌，所以還需要指紋圖譜作為補充。

從已有文獻可知，人參類藥材指紋圖譜多采用HPLC-DAD分析檢測^[13-25]，少數(shù)采用HPLC-ELSD^[26-27]，但后者僅僅限于西洋參的研究。HPLC分析時間通常為80～120 min，確定的共有峰數(shù)目多在11～30個，最多指認了11個色譜峰^[23]，而且所指認的成分均為人參類藥材多成分含測中通常定量的成分，對其他含量較低或者分離困難的成分仍然沒有明確。近年來，也有人采用UPLC-DAD對人參類藥材的指紋圖譜進行了研究，分析時間較HPLC方法大大縮短（通常為12～30 min），但選定的共有峰僅有12～15個，指認色譜峰數(shù)目也只有8～10個^{[17，24，26]}。因此，雖然分析時間縮短，但在人參類藥材皂苷類成分整體表征上UPLC方法較HPLC方法并沒有實質(zhì)性突破，其原因還是各成分的分離度不夠好，并沒有真正發(fā)揮出UPLC的儀器優(yōu)勢。

綜上所述，全面評價人參類藥材質(zhì)量的當務之急應該在指紋圖譜的研究上有所突破。那么如何突破？改進色譜條件、提高色譜峰的分離度、提高色譜峰的純度、增加共有峰數(shù)目、增加指認峰的數(shù)目就是需要突破的關鍵點。

因此，本研究以人參類藥材中所含皂苷類成分相對最為復雜的紅參為研究對象，采用Waters ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀和ACQUITY UPLC BEH C₁₈填料色譜柱，建立了具有高分離度、高色譜峰純度、操作簡單、高效快速、易于重復的紅參UPLC指紋圖譜測定方法，所建立的方法可為提高人參、紅參和西洋參的質(zhì)量控制標準提供參考。

1 材料

美國Waters Acquity UPLC H-Class Core System，Acquity UPLC PDA Detector，Empower色譜工作站。KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），功率250 W，工作頻率40 kHz；XS205型1/10萬天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

對照品人參皂苷Rg₁（批號110703-201027，按96.3%計）、人參皂苷Re（批號110754-200822，按88.8%計）、人參皂苷Rb₁（批號110704-200420）、人參皂苷Rb₂（批號111715-200802，按94.8%計）和人參皂苷Rb₃（批號111686-201002，按92.7%計）均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。人參皂苷Rf（批號R-040-120617）、人參皂苷Rc（批號R-008-120628）、人參皂苷Rd（批號R-009-120826）、人參皂苷20（S）-Rg₃（批號R-010-120506）和人參皂苷Ro（批號R-032-130408）均購自瑞芬思生物科技有限公司，經(jīng)面積歸一化法測定，純度>98%。

乙腈、甲醇均為色譜純（HPLC級，美國Fisher公司），水為超純水由Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）制備，其余試劑均為分析純。

紅參為購自各地藥材商店/市場的市售飲片/藥材。見表1。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立及方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLCBEH C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，洗脫程序：0～2.2 min，19% A；2.2～3.5 min，19%～25% A；3.5～5.7 min，25% A；5.7～10 min，25%～33% A；10～12 min，33%～40% A；12～16 min，40%～50% A；16～19 min，50%～60% A；19～25 min，60%～100% A；25～30 min，100% A；檢測波長203 nm；流速0.5 mL·min^-1；進樣量20 μL，柱溫30 ℃。理論板數(shù)按人參皂苷Rb₁峰計算應不低于1萬，見圖1。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過40目篩）約0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，室溫放置1 h，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 mL，減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 取對照品人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh₁、人參皂苷Rg₂、人參皂苷Rb₁、20（S）-人參皂苷F₁、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、20（S）-人參皂苷Rg₃、20（R）-人參皂苷Rg₃適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中分別含上述人參皂苷0.145，0.070 0，0.133， 0.110，0.053 0，0.096 0，0.062 5，0.039 0，0.075 0，0.180，0.047 0 mg的混合對照品溶液，備用。

2.1.4 精密度試驗 取同一份紅參（編號20）供試品溶液，按2.1.1項下方法連續(xù)進樣6次，記錄UPLC圖譜。以人參皂苷Rb₁為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果各共有峰相對保留時間的RSD均<2%，相對峰面積的RSD均<2%，測定結果符合中藥指紋圖譜的要求。表明儀器的精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取紅參粉末（編號20）約0.5 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后的第0，1，2，4，6，8，10，12，16，24 h按2.1.1項下方法進樣，記錄UPLC圖譜。以人參皂苷Rb₁為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果各共有峰相對保留時間的RSD均<2%，相對峰面積的RSD均<2%，測定結果符合中藥指紋圖譜的要求。表明24 h內(nèi)，供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取紅參粉末（編號20）約0.5 g，平行6份，分別按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下方法進樣，記錄UPLC圖譜。以人參皂苷Rb₁為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果各共有峰相對保留時間的RSD均<2%，相對峰面積的RSD均<2%，測定結果符合中藥指紋圖譜的要求。表明本方法的重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立與共有峰的確定

取22批紅參樣品，分別按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下確定的色譜條件進樣，記錄UPLC圖譜。在22批紅參的指紋圖譜中共獲得26個共有峰，經(jīng)與人參皂苷對照品對照，對其中11個共有峰進行了指認，分別為：人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh₁、人參皂苷Rg₂、人參皂苷Rb₁、20（S）-人參皂苷F₁、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、20（S）-人參皂苷Rg₃、20（R）-人參皂苷Rg₃。

2.3 共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積

本研究中鑒于人參皂苷Rb₁有法定供貨渠道作保證，在紅參中的相對含量較高，化學結構相對穩(wěn)定、保留時間居中，且在本色譜分離中分離度、色譜峰純度等方面均符合含量測定的要求，因此確定以人參皂苷Rb₁為參照峰（峰10，S），其余各共有峰的保留時間和峰面積與S峰的比值定義為其余各峰的相對保留時間和相對峰面積。按以上方法計算22個產(chǎn)地藥材的26個共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見圖2，表2，3。

2.4 相似度評價

將所得到的22批紅參UPLC色譜圖數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會“中藥指紋圖譜評價系統(tǒng)”（2008版），通過軟件分析，得到紅參藥材的UPLC指紋圖譜。22批紅參藥材的相似度計算結果顯示：22批紅參藥材與對照特征圖譜相似度在 0.699～0.983，平均相似度為 0.896，RSD為 8.3%。22批藥材中有 18批藥材相似度大于0.9，有2批藥材相似度在0.8～0.9，還有2批藥材相似度在0.7～0.8，表明建立的紅參UPLC指紋圖譜較合理， 見表4。

3 結果與討論

在流動相的選擇上，曾采用相同的梯度洗脫條件分別對乙腈-水系統(tǒng)和乙腈-0.1%的甲酸水系統(tǒng)進行了篩選，結果發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.1%的甲酸水系統(tǒng)下，基線波動較大，各色譜峰峰形較差，拖尾現(xiàn)象嚴重，而乙腈-水系統(tǒng)下則基線較平穩(wěn)，能獲得良好的色譜峰對稱性，分離效果較理想，因此確定采用乙腈-水作為流動相系統(tǒng)組成進行色譜分離。

文獻報道人參類藥材供試品溶液的制備方法有固相萃取法^[3]、正丁醇萃取法^[28]和大孔樹脂法^[31]，試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過富集后的紅參供試品溶液與采用直接超聲提取法制備的供試品溶液的色譜分離效果基本一致，大孔樹脂法損失較大，故采用超聲提取法直接制備供試品溶液。

本研究建立的紅參UPLC指紋圖譜在短短30 min內(nèi)實現(xiàn)了對紅參的快速色譜分離，與以往文獻報道的紅參指紋圖譜^[20-26]相比較，具有高效、專屬性強、分離度高、色譜峰純度高、重現(xiàn)性強、方法簡單易行的特點。該指紋圖譜可同時對紅參中48個共有峰進行檢測，忽略掉含量相對較低的一些特征峰后，定義了26個特征峰，同時采用中藥對照品對其中11個色譜峰進行了指認，其中不僅包括了紅參中常見的原生皂苷人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb₂和人參皂苷Rb₃，同時還涵蓋了人參加熱炮制后水解生成的次生皂苷，即人參皂苷Rh₁、20（S）-人參皂苷Rg₃、20（R）-人參皂苷Rg₃、人參皂苷Rg₂、人參皂苷F₁。特別是其中紅參的主要標志化合物20（S）- 人參皂苷Rg₃和20（R）- 人參皂苷Rg₃這一組差向異構體的檢出和指認，可據(jù)此對紅參的炮制工藝更好地進行過程控制。

中藥指紋圖譜技術作為一種中藥質(zhì)量評價模式具有整體性、宏觀性和模糊性的特點，目前在國內(nèi)外能被業(yè)界廣為接受和采用，主要是基于指紋圖譜的整體和宏觀性，如果能與多指標成分定量更好地融

合在一起，使其模糊性逐漸清晰，將是中藥質(zhì)量評價未來發(fā)展的方向。本研究通過進行紅參高分離度和高色譜峰純度的色譜分離，最終建立了可同時進行多成分質(zhì)量評價的特色紅參指紋圖譜。由于紅參是人參類藥材中所含成分相對較為豐富的品種，因此本研究建立的紅參UPLC指紋圖譜實際上也為人參、紅參、西洋參及其他人參加工品的品種鑒定及質(zhì)量控制提供了可行的方法，可為《中國藥典》中紅參的質(zhì)量標準提高提供參考。

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[責任編輯 丁廣治]