重組人血白蛋白工業(yè)應(yīng)用研究進(jìn)展

王宗太　馬寧寧

[摘要]人血清白蛋白（HAS）在人血漿中的含量最為豐富，是蛋白質(zhì)的一種，在血漿總蛋白中所占約60%的比重，生理功能不僅重要，而且較多，同時其也是制藥工業(yè)中最為重要的一種原輔助料。當(dāng)前市場中銷售的HSA大部分為提取與人血漿，但是血液的隱藏風(fēng)險較大，這就使得基因重組人血清蛋白（rHSA）成為HSA的首選替代品。本文重點介紹了重組人血清白蛋白在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]重組白蛋白；細(xì)胞培養(yǎng)；藥用輔料

[中圖分類號] R977.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（a）-0011-04

The pharmaceutical application research progress of industrial production of Human serum albumin

WANG Zong-tai1，2 MA Ning-ning1

1.Shenyang Pharmaceat：cal University，Liaoning Province，Shenyang 110016，China；2.Biotechnology Branch of worth China Phanmacetice co，Lal，Hebei Province，Shijiazhoang 056215，China

[Abstract]Human serum albumin（HAS） is the most abundant in human plasma，is a protein，in the plasma total protein accounted for about 60% of the proportion of physiological function is not only important，but also more，but also the pharmaceutical industry The most important of a kind of raw auxiliary materials. Most of the HSA sold in the current market is extracted with human plasma，but the risk of blood is greater，which makes the recombinant human serum albumin（rHSA） a preferred alternative to HSA.The pharmaceutical application research progress of industrial production of rHSA were reviewed in this article.

[Key words]Recombinant albumin；Cell culture；Excipient

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的50%～60%[1]。HSA屬于一種單鏈無糖基化蛋白質(zhì)，組成為585個氨基酸，分子量是66.5 kD，等電點介于4.7～4.9。整個分子盤旋成心型，其三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 人血清蛋白分子結(jié)構(gòu)圖

HAS具有廣泛的臨床應(yīng)用和工業(yè)應(yīng)用，國內(nèi)主要生產(chǎn)廠家有成都蓉生、山東泰邦、華蘭生物、四川遠(yuǎn)大蜀陽、山西康寶、上海生物制品研究所、上海萊士等。2015年國內(nèi)批簽發(fā)HAS約323噸，自2012年起連續(xù)四年增長率保持在10%以上，且由于血漿的短缺，進(jìn)口產(chǎn)品約占58.7%，國內(nèi)市場供應(yīng)始終處于緊張狀態(tài)。同時，HSA的市場售價相對較高，最高可達(dá)每克40元，進(jìn)而導(dǎo)致我國各大醫(yī)院的HSA儲備量告急的情況，國家也不得不制定多種限制性較強(qiáng)的措施改善現(xiàn)狀。這也間接導(dǎo)致了HSA的黑市高價交易等畸形銷售現(xiàn)象。人們生活水平的額提升導(dǎo)致血液資源愈發(fā)緊張，HSA的緊缺情況也沒有良好的改善，形勢嚴(yán)峻?，F(xiàn)階段，臨床及市場中大量應(yīng)用的HSA的提取制備方法是低溫乙醇法（Chon）與柱層析法[2-3]，被提取物為人類血漿。然而，人類血液中存在慢性乙肝、艾滋病等傳染性疾病因子的可能性較大，且即使經(jīng)過純化工藝也難以保證不會將病毒帶入產(chǎn)品中；另一方面血液供應(yīng)也有限，特別是近年來生物醫(yī)藥快速發(fā)展，人血白蛋白作為工業(yè)原輔料的需求量越來越大，使本來臨床短缺的白蛋白更是雪上加霜，因此，尋找血液替代品迫在眉睫。

1 HAS的發(fā)展

1981年，Genentech公司的Lwan及另外幾位員工首次對重組人血蛋白（rHSA）CDNA序列進(jìn)行了專業(yè)性報道，并且第一次應(yīng)用色氨酸（Trp）啟動子。色氨酸引導(dǎo)源于質(zhì)粒pBR322的TC一和AmP基因，其共同構(gòu)造出全球首個rHSA表達(dá)載體Phsai，并取得了其在大腸埃希菌中的成功表達(dá)。30多年來，國際上許多實驗室和公司都嘗試通過遺傳工程開發(fā)rHSA，且已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀見表1。

華北制藥經(jīng)過十幾年的技術(shù)研發(fā)，構(gòu)建了穩(wěn)定、高效分泌表達(dá)基因工程菌，擁有菌種構(gòu)建、發(fā)酵、純化等完整的自主知識產(chǎn)權(quán)，其中，純化工藝專利在十三個國家獲得授權(quán)。2011年建成符合cGMP生產(chǎn)線，產(chǎn)業(yè)化能力6噸/年，發(fā)酵單位達(dá)10 g/L以上，產(chǎn)率20%以上。相比由血漿提取HSA，采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)rHSA，有明顯優(yōu)勢：①嚴(yán)格按照生物制品標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)大的工藝穩(wěn)定性，很好的批次均一性；②純度控制標(biāo)準(zhǔn)高于藥典對HSA規(guī)定，純度高達(dá)99%以上；③熱原優(yōu)勢更明顯，內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)高于國家藥典對血源性HSA的規(guī)定；④具有血源HSA一致的氨基酸組成，有相同的理化特性；⑤無任何動物來源成份，遠(yuǎn)離血源性病毒污染，rHSA更安全；⑥原輔料沒有制約，產(chǎn)量能滿足市場供應(yīng)。目前國內(nèi)僅有華北制藥具備了產(chǎn)業(yè)化條件，但是rHSA的工業(yè)應(yīng)用尚處于前期，市場還在逐步培育，6噸/年產(chǎn)能還沒有完全釋放，按照目前的技術(shù)指標(biāo)，滿產(chǎn)后的成本相比HAS具有非常強(qiáng)的市場競爭力（圖2）。

圖2 工藝流程框圖

華北制藥研制的rHSA具有與血源白蛋白相同的結(jié)構(gòu)、理化特性。近年來，有越來越多的關(guān)于rHSA非治療作用的應(yīng)用研究報道，如用于細(xì)胞培養(yǎng)促進(jìn)劑、蛋白類藥物穩(wěn)定劑、藥物和基因轉(zhuǎn)運載體、化妝品添加劑等。

2作為培養(yǎng)基的重要組分促進(jìn)細(xì)胞正常生長

rHSA在動物細(xì)胞及胚胎培養(yǎng)中的生理功能較多[4]，能夠作為自由基清除劑、重金屬螯合劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑以及營養(yǎng)物進(jìn)行使用。它還可與維生素或激素等藥物相結(jié)合，進(jìn)而進(jìn)入動物細(xì)胞中，提升細(xì)胞的生長速度，消除毒素以及蛋白酶等物質(zhì)，減少其對細(xì)胞生長的不良影響。

2.1支持低密度CHO細(xì)胞生長

生命科學(xué)近年來發(fā)展迅速，哺乳動物細(xì)胞在生命科學(xué)中發(fā)揮著重要作用。動物源血清營養(yǎng)豐富，是細(xì)胞培養(yǎng)的良好培養(yǎng)基，但是動物源血清具有潛在的風(fēng)險，是監(jiān)管的難題。為證明rHSA聯(lián)合化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基能夠支持低密度細(xì)胞的生長，Zhu等開展了細(xì)胞培養(yǎng)試驗，結(jié)果表明在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)比例的rHSA，能有效支持低密度CHO細(xì)胞的生長[5]。

2.2對Vero、HKC細(xì)胞的促生長作用

在狂犬疫苗的生產(chǎn)過程中，無論是使用Vero細(xì)胞還是HKC細(xì)胞培養(yǎng)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適當(dāng)比例的HSA能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞生長，從而提高病毒表達(dá)。利用生物技術(shù)生產(chǎn)的rHSA與HSA具有相同的結(jié)構(gòu)和理化特性，理論上應(yīng)該對同等細(xì)胞的生長具有與HAS相同的促進(jìn)作用。我們開展了大量的對比試驗：針對Vero細(xì)胞[6]、HKC細(xì)胞等細(xì)胞，利用的培養(yǎng)基分別含相同比例的HAS和rHSA。試驗結(jié)果證實，rHSA與HAS一樣對Vero、HKC細(xì)胞有促生長作用。

2.3 rHSA在低溫貯藏和細(xì)胞復(fù)蘇方面的作用

生物制品生產(chǎn)過程中及細(xì)胞庫中廣泛利用冷凍技術(shù)進(jìn)行種子細(xì)胞的保存。用rHSA以培養(yǎng)基組分的形式進(jìn)行細(xì)胞凍存，其效果與胎牛血清的作用相似，相比市面上常見的冷凍劑，rHSA對細(xì)胞增長的維持以及存活作用更為理想。通過用rHSA替代胎牛血清進(jìn)行低溫貯藏和復(fù)蘇的研究[7]，表明rHSA應(yīng)用于細(xì)胞低溫貯藏是可行的。

3作為輔料是蛋白或肽類藥物的良好穩(wěn)定劑

在實際藥物以及生物制品的生產(chǎn)工作中，為提升其穩(wěn)定性需添加一定量的穩(wěn)定劑。HSA作為穩(wěn)定劑現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于當(dāng)前市場銷售的生物制劑中，其用量介于0.1%～0.2%。其被用作穩(wěn)定劑的原因包括：①rHSA的穩(wěn)定性良好，溶解性較為理想；②rHSA可以阻斷蛋白質(zhì)對容器壁的吸附。因此，rHSA在疫苗等制品中的應(yīng)用率較高。血源HSA具有被污染的風(fēng)險，也會因為其結(jié)構(gòu)差異、生產(chǎn)批次不穩(wěn)定等原因出現(xiàn)各種問題，因此，rHSA有望代替HSA作為藥物穩(wěn)定劑[8]。美國FDA將rHSA作為藥用輔料已經(jīng)收載入藥典，默克公司利用rHSA為輔料的麻腮風(fēng)三聯(lián)疫苗已經(jīng)獲得美國FDA批準(zhǔn)上市。

3.1抗氧化作用

rHSA具有一定的抗氧化作用，該作用的存在于其分析結(jié)構(gòu)之間關(guān)系密切。rHSA中存在的大量點位均具有良好的抗氧化活性[9]。比如，rHSA中存在的自由半胱氨酸殘基Cys-34是一種還原性巰基，對rHSA發(fā)揮抗氧化功能具有重要作用。rHSA中含有6個蛋氨酸殘基，該物質(zhì)上也有一定的巰基，對氧化作用具有高度敏感性，并在發(fā)生氧化作用后產(chǎn)生蛋氨酸亞砜殘基。長鏈脂肪酸結(jié)合于rHSA中的Lys-351、Lys-475、Arg-117對脂肪酸有良好的保護(hù)作用，可減少自由基對其的攻擊。同時，rHSA的Lys-240與膽紅素相結(jié)合后，會對脂質(zhì)過氧化進(jìn)行良好抑制。

3.2增強(qiáng)藥物的靶向性及安全性

增強(qiáng)藥物的靶向性對藥物有效性以及安全性的提升均有重要意義。HSA是抗腫瘤藥物的主要載體，其具備載藥量高、穩(wěn)定性好、緩釋靶向的特點[10]。2005年FDA批準(zhǔn)APP公司的以HSA為載體的紫杉醇產(chǎn)品Abraxane上市， Abraxane具有勝過紫杉醇注射液的顯著優(yōu)點。rHSA也同樣可以作為一種藥物載體，通過不同的方式使藥物的靶向性得到增強(qiáng)。一方面，藥物可以制作成rHSA的納米制劑，就可以減少藥物的毒副作用，提高有效性。另一方面通過對rHSA加以修飾后，使其與靶蛋白結(jié)合配體以及藥物相連接，促使藥物實現(xiàn)靶向作用。

3.3藥物傳輸系統(tǒng)中的載體

rHSA是人體血腦屏障運輸載體，同時也轉(zhuǎn)運非入侵性基因。一般來說，人體內(nèi)的蛋白質(zhì)以及肽類藥物滲入血腦屏障的難度很大，但是嵌合肽的應(yīng)用則能夠?qū)⑸鲜鰞深愃幬镛D(zhuǎn)運至血腦屏障內(nèi)。無法進(jìn)行轉(zhuǎn)運的肽類藥物能夠和血腦藥物的運載體共同形成一種嵌合肽[11]，而已經(jīng)被陽離子化的rHSA中存在的氨基酸基團(tuán)能夠與多種化合物相結(jié)合。其與血腦屏障內(nèi)皮中存在的多糖蛋白復(fù)合物產(chǎn)生靜電作用，而陽離子化白蛋白-β-內(nèi)啡嵌合肽就會借助介導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運作用進(jìn)入大腦組織中。

3.4藥物在體內(nèi)半衰期被延長

HSA具有增加被結(jié)合蛋白分子質(zhì)量，保護(hù)被結(jié)合蛋白的作用，當(dāng)其與多肽類藥物或者蛋白質(zhì)結(jié)合后，會使其在人體內(nèi)的半衰期有顯著延長現(xiàn)象。糖尿病的臨床治療中，胰島素是常用藥物之一，但因其生物半衰期相對較短，因此需要增加用藥頻率以保證療效。Dut-taroy等在研究中，將單鏈人胰島素基因以及HSA二者相融合，最終獲得半衰期較長的胰島素，減少了給藥頻率[12]。另外，有研究中將馬來酰亞胺衍生物與HSA相結(jié)合，進(jìn)而獲得半衰期較長的胰島[13]。

4 rHSA的其他應(yīng)用

4.1 rHSA突變體

臨床中主要通過光線療法對新生兒科黃疸疾病以及Ⅰ型Crigler-Najjar綜合征予以治療，而光線療法結(jié)合重組白蛋白后再使用可快速有效的降低血清中尚未結(jié)合的膽紅素水平。Crigler-Najjar綜合征治療的過程中，最為關(guān)鍵的治療點在于維持膽紅素濃度，一般在20.0 nmol/L左右。除此之外，還需要保證膽紅素整體濃度不能超過HSA的整體結(jié)合水平[14-15]。當(dāng)光線療法與rHSA相結(jié)合應(yīng)用時能夠?qū)⒛懠t素進(jìn)行溶解，使其成為無毒性異構(gòu)體之一。有相關(guān)研究結(jié)果顯示，改異構(gòu)體的構(gòu)成及構(gòu)成速度和與rHSA結(jié)合的膽紅素構(gòu)象、電子環(huán)境關(guān)系緊密，因此產(chǎn)生的rHSA突變體能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量具有較強(qiáng)可溶性的膽紅素光合物，其與野性HSA相比，在提升光線治療效果中價值更高[16]。同時，rHSA突變體能夠作為一種體外解毒劑作用在白蛋白透析中。

4.2 rHSA應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域中的分析

由于rHSA的特性，其在化妝品領(lǐng)域是被作為水溶性蛋白而應(yīng)用的，是一種中性緩沖液，其生物兼容性十分良好，其應(yīng)用于人體皮膚表面時，會在上面覆蓋一層具有保護(hù)作用的薄膜，對去除皺紋、細(xì)紋具有良好的作用，同時還能夠讓使用者的皮膚變得更加透亮嫩滑[17]。在化妝品領(lǐng)域中，rHSA常以活性化合物被應(yīng)用于各種化妝品中，相對來說，洗劑和霜劑中的rHSA含量較高，使用者通過洗劑和霜劑的應(yīng)用來吸收rHSA，以此對肌膚進(jìn)行調(diào)理。白蛋白純化液對面部皮膚因老化而產(chǎn)生的魚尾紋具有迅速的消除功效。在美國的一家化妝品公司，NEW CENTURY申請了一項專利，其主要內(nèi)容為在該公司旗下的面霜、肥皂、洗發(fā)露等洗護(hù)產(chǎn)品中添加一定量的rHSA，使其在應(yīng)用過程中能夠吸附在使用者的皮膚以及頭發(fā)表面，發(fā)揮其組織修復(fù)作用，快速修復(fù)使用者受損發(fā)質(zhì)以及肌膚，同時rHSA作為活性成分具有減少過敏反應(yīng)的作用[18]。例如，在洗發(fā)產(chǎn)品中添加適量的rHSA會減緩患者頭皮發(fā)癢的感覺，消除頭皮屑。而在國內(nèi)專利中，一種具有保濕、防裂、改善皮膚粗糙暗沉的潤膚霜中添加了甘草提取液、甘油成分以及rHSA后，使其上述功效得以最大發(fā)揮。

4.3在醫(yī)療器械方面的應(yīng)用

rHSA與聚乙二醇（PEG）組成聚合物水凝膠已經(jīng)成為醫(yī)療器械領(lǐng)域里的新成員，當(dāng)這兩種成分結(jié)合時，快速的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生水凝膠基質(zhì)，具有強(qiáng)固的黏附性，這項技術(shù)讓外科醫(yī)生針對患者的胸腔手術(shù)，肺部漏氣癥狀等可以進(jìn)行更有效的手術(shù)。目前國內(nèi)外許多公司正努力將此技術(shù)的應(yīng)用平臺擴(kuò)展到脊柱、普通外科和婦產(chǎn)科等臨床領(lǐng)域。國外Neomend公司應(yīng)用諾維信生產(chǎn)的rHSA制造了應(yīng)用于外科手術(shù)的密封膠ProGEL？誖LATINUM，已獲得歐盟CE標(biāo)識。自2010年4月起，該技術(shù)已在美國8000多病例中得到應(yīng)用。

5展望

HSA是常用的臨床藥物，也廣泛應(yīng)用于生物藥物的工業(yè)生產(chǎn)，可作為細(xì)胞培養(yǎng)基的重要組分、蛋白質(zhì)類藥物或肽類藥物的穩(wěn)定劑、藥物傳輸系統(tǒng)中的載體等等。隨著現(xiàn)代DNA重組技術(shù)、大規(guī)模培養(yǎng)和純化技術(shù)的發(fā)展，國際、國內(nèi)都實現(xiàn)了rHSA大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，且研究結(jié)果表明產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與HAS無明顯差異。rHSA作為臨床用藥、藥用輔料、細(xì)胞培養(yǎng)基組分在國外都有廣泛應(yīng)用，國內(nèi)的相關(guān)研究也都取得了實質(zhì)性的進(jìn)展。rHSA替代HAS具有廣泛的社會意義，也是生物技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。

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（收稿日期：2017-05-21 本文編輯：崔建中）