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    采用Percoll液純化分離貯精腺細(xì)胞試驗(yàn)

    2017-04-10 01:02:59徐鑫
    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2017年4期
    關(guān)鍵詞:純化細(xì)胞培養(yǎng)

    徐鑫

    摘要 以新?lián)P州雞為素材,用膠原酶/透明質(zhì)酸酶和各梯度濃度的Percoll液的方法分離子宮陰道交接處(UVJ)的貯精腺細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以達(dá)到細(xì)胞純化的目的,旨在建立雞貯精腺細(xì)胞純化分離和培養(yǎng)技術(shù),為進(jìn)一步研究和分析貯精腺的構(gòu)造和功能,以及調(diào)控機(jī)理的研究提供技術(shù)平臺(tái)。結(jié)果表明:用膠原酶/透明質(zhì)酸酶分離培養(yǎng),消化45 min,100目過(guò)濾的貯精腺細(xì)胞用Percoll液原代培養(yǎng)至少存活120 h,細(xì)胞的純化效果很明顯。

    關(guān)鍵詞 新?lián)P州雞;Percoll液;透明質(zhì)酸酶;貯精腺;純化;細(xì)胞培養(yǎng)

    中圖分類號(hào) Q50 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739(2017)04-0233-01

    動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)初,到1962年規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大,發(fā)展至今已成為醫(yī)學(xué)、生物研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法,具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等可通過(guò)利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn),這已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分[1]。

    動(dòng)物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣,在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比有顯著差別:①動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多,無(wú)細(xì)胞壁,機(jī)械強(qiáng)度低,對(duì)剪切力敏感,適應(yīng)環(huán)境能力差;②培養(yǎng)過(guò)程需氧量少;③倍增時(shí)間長(zhǎng),生長(zhǎng)緩慢,易受微生物污染,培養(yǎng)時(shí)須用抗生素;④原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡;⑤培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在;⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性,生產(chǎn)成本高,但附加值也高[1-5]。

    Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20 mosm/kg H2O),黏度也很小,可形成高達(dá)1.3 g/mL密度,采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力[(200~1 000)g]于數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果[6-9]。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低,所形成的梯度十分穩(wěn)定[10-15]。此外,Percoll不穿透生物膜,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害,因而廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒,還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離[16]。

    家禽輸卵管由漏斗部、膨大部、峽部、子宮部和陰道部組成[11],陰道部較短,呈“S”狀彎曲,其中子宮陰道交接部存在一種特殊的管狀腺,該腺體由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成,腺管細(xì)胞頂部無(wú)纖毛,細(xì)胞核排列整齊,位于細(xì)胞的基部,因精子在此貯存而被稱為貯精腺[12],貯精腺的存在使禽類精子在輸卵管內(nèi)可以長(zhǎng)期存活,一般為2~3周,并能長(zhǎng)時(shí)間保持受精能力[12-13]。本次試驗(yàn)用新?lián)P州雞為素材,用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化分離子宮陰道交接處(UVJ)的貯精腺細(xì)胞[16-19],并用各梯度濃度的Percoll液純化貯精腺細(xì)胞,旨在建立雞貯精腺細(xì)胞純化分離和培養(yǎng)技術(shù),為貯精腺調(diào)控機(jī)理的研究提供技術(shù)平臺(tái)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)選用4只處于盛產(chǎn)期的新?lián)P州雞貯精腺為素材,采用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化分離子宮陰道交接處(UVJ)的貯精腺細(xì)胞,并用各梯度濃度的Percoll液純化貯精腺細(xì)胞[20-24]。

    試驗(yàn)儀器和試驗(yàn)試劑有無(wú)菌室和無(wú)菌操作臺(tái),體視顯微鏡,天平(稱量所取組織或黏膜),離心機(jī),臺(tái)式天平(離心時(shí)平衡用),鋁盒1個(gè)(盛器皿),大瓷盤(pán)1個(gè)(采樣用),小瓷盤(pán)1個(gè)(裝冰用),大剪刀1把(剖雞),解剖剪2把(剪子宮陰道部),解剖刀2把,眼科剪2把(將組織剪成小塊),小鑷子4 把,小培養(yǎng)皿6個(gè),西林瓶6個(gè),廢液瓶1個(gè)(500 mL燒杯代替),100目過(guò)濾篩1個(gè),0.1%明膠預(yù)處理過(guò)的4孔細(xì)胞培養(yǎng)板若干個(gè),吸管20支,50~100 mL三角瓶(或稱錐形瓶)2個(gè),10 mL試管2個(gè)(套帽),紅血球計(jì)數(shù)板,載玻片,蓋玻片,1 000、100、10 μL槍各1把,10 mL試管8個(gè)(套帽)。膠原酶/透明質(zhì)酸酶無(wú)菌PBS(pH值7.2~7.4),DMEM 培養(yǎng)液,滅活血清,酒精棉,慶大霉素1支,臺(tái)盼藍(lán)染液。各梯度濃度的 Percoll。

    1.2 試驗(yàn)方法

    膠原酶/透明質(zhì)酸酶、培養(yǎng)液DMEM、碎冰入無(wú)菌室內(nèi),無(wú)菌室和無(wú)菌操作臺(tái)用紫外線消毒0.5~1.0 h。酒精棉消毒大瓷盤(pán)、大剪刀、鑷子、解剖剪各1把入解部室,用時(shí)再酒精燈消毒。慶大霉素1支(80萬(wàn)U)入消過(guò)毒的PBS。雞固定于大瓷盤(pán),大剪刀剖1只雞腹,暴露生殖道,用鑷子夾住子宮陰道部,解剖剪剪下UVJ入含PBS的培養(yǎng)皿。縱剖UVJ,并縱向分成2個(gè)部分,入無(wú)菌室。洗滌入另一PBS培養(yǎng)皿,去結(jié)締組織。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)解剖剪剪碎,入含PBS培養(yǎng)皿。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將樣品、吸管用酒精燈消毒。用吸管吹打樣品管,吸PBS入廢液瓶。換吸管并用酒精燈消毒。用吸管加膠原酶/透明質(zhì)酸酶20 mL入三角瓶,加5 mL DMEM。置37 ℃水浴鍋內(nèi)振蕩消化45 min,入碎冰盤(pán)終止消化。同時(shí)做4個(gè)梯度離心管:滅活血清將10 mL離心管潤(rùn)洗1次,每個(gè)離心管用1 000 μL槍依次取1 mL 70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%的Percoll液入10 mL離心管(注意離心管內(nèi)Percoll液體從底部至頂部依次從高濃度到低濃度,各層不得相互混合)。100目過(guò)濾入三角瓶,吸管吸入10mL離心管,蓋帽,1 000 r/min 7~8 min,灑精棉擦離心管外壁四周,無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)消毒試管,上清液入廢液瓶,換吸管并用酒精燈消毒[25-26]。下層細(xì)胞用DMEM稀釋(用1 mL槍吸DMEM培養(yǎng)基入試管,總用量為5 mL)。先取DMEM入1個(gè)試管,吸打并移入另一試管,兩者混合吹打均勻成細(xì)胞懸液。在4個(gè)梯度離心管頂層加1 mL分離的細(xì)胞液,蓋帽。從超凈臺(tái)內(nèi)取出。以1 400~2 500 r/min離心25 min。100 μL槍收集每層細(xì)胞置10 mL離心管,加5倍(下轉(zhuǎn)第236頁(yè))

    (上接第233頁(yè))

    體積PBS洗滌,以1 000 r/min離心10 min。重復(fù)洗滌1次。加1 mL DMEM重懸細(xì)胞。用槍取10 μL細(xì)胞至載玻片,用體視顯微鏡觀察,照相;10 μL樣于10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)死活細(xì)胞數(shù)。 細(xì)胞原液、各層純化的細(xì)胞調(diào)整密度至3×106個(gè)/mL,4孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。板孔底部最好不要有氣泡,可用吸管將氣泡吸出,蓋上瓶蓋。標(biāo)記日期及樣品名稱,移至38.5 ℃的CO2培養(yǎng)箱,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

    2 結(jié)果與分析

    試驗(yàn)結(jié)果表明,膠原酶/透明質(zhì)酸酶,Percoll液純化分離,消化45 min,100目過(guò)濾的貯精腺細(xì)胞的細(xì)胞純度很高(圖1),基本都是所需要的細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)目多,完整性好,貼壁效果好,比沒(méi)用Percoll液分離的效果更加明顯更清楚,更加有利于進(jìn)一步分離培養(yǎng)。

    3 結(jié)論與討論

    密度梯度離心技術(shù)是早期應(yīng)用的一種細(xì)胞分離、純化的方法,是Brakke于1951年提出來(lái)的,其基本原理是利用離心溶液介質(zhì)所形成的密度梯度來(lái)維持重力的穩(wěn)定性和抑制對(duì)流,待分離顆粒的密度在離心溶液的梯度柱密度范圍內(nèi),經(jīng)過(guò)一定時(shí)間離心后,不同密度的顆粒分別集中在離心溶液某密度帶上而得以分離[16]。Percoll細(xì)胞分離液是一質(zhì)優(yōu)的分離介質(zhì),與Ficoll相比其黏度低、穩(wěn)定,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用,顆粒大易于從細(xì)胞表面洗脫下來(lái),更重要的是Percoll在高速離心(>10 000 r/min)時(shí)可產(chǎn)生連續(xù)梯度,利用這一特點(diǎn)先處理細(xì)胞懸濁液,光鏡下幾乎沒(méi)見(jiàn)到細(xì)胞間的聚集。Percoll液顆粒大小不一,離心后可形成一定的密度梯度,不同密度的細(xì)胞分布于不同密度的層內(nèi),借此可將貯精腺細(xì)胞和雜細(xì)胞及細(xì)胞碎片分離。本試驗(yàn)利用Percoll密度梯度離心法快速穩(wěn)定,而且便于提純和體外培養(yǎng),細(xì)胞成活率高,取得了比較滿意的效果。

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,用Percoll細(xì)胞分離液和膠原酶/透明質(zhì)酸酶分離貯精腺細(xì)胞的效果非常明顯,純度很高,并且分離出的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的效果也很好,這2種試劑組合有利于細(xì)胞的分離培養(yǎng),為進(jìn)一步研究貯精腺的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

    4 參考文獻(xiàn)

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