大鼠表皮干細胞分離培養(yǎng)的方法研究

摘要：目的是探討大鼠表皮干細胞的分離培養(yǎng)的方法。方法主要以0 ～7日齡SD大鼠為材料，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶分離表皮細胞，IV型膠原黏附法對分離的表皮干細胞進行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)、生長情況。結果是培養(yǎng)后的表皮干細胞胞質(zhì)近中央處有圓形核并開始形成小克隆，細胞即連接成片，緊密相靠，相互銜接，呈鋪路石狀。結論為該方法分離培養(yǎng)的表皮干細胞純合，呈現(xiàn)典型的上皮型細胞形態(tài)，可用于皮膚的再生修復。

關鍵詞：表皮干細胞；細胞分離；細胞培養(yǎng)

中圖分類號： Q593. 2 文獻標識碼： A 文章編號： 1674-0432（2014）-18-17-1

表皮干細胞也可稱角質(zhì)干細胞，不同部位的表皮干細胞分布存在差異，其主要分布于表皮基底層和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺邊緣[1]。表皮干細胞在維持皮膚的自我更新、創(chuàng)傷修復、皮膚腫瘤的發(fā)生等方面扮演著重要的角色，因此成功地分離、培養(yǎng)表皮干細胞對臨床上創(chuàng)傷修復、皮膚癌的研究起著至關重要的作用[2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及用具

1.1.1實驗材料 0～7日齡SD大鼠。

1.1.2實驗試劑 中性蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA消化液，IV型膠原，DMEM培養(yǎng)液，D-Hanks，KSFM培養(yǎng)液，凍存液，75%酒精。

1.1.3實驗用具 剪刀、鑷子、尼龍紗網(wǎng)、手術刀、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、凍存管、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺，電子顯微鏡，離心機等。

1.2 實驗方法

1.2.1表皮細胞的分離 取0 ～7日齡SD大鼠，脫頸錐處死， 75%酒精清洗，剪取背部皮膚，D-Hanks清洗，將其切割為0.5×1.0厘米的皮膚組織，0.25%中性蛋白酶在4℃處理12～16小時，吸棄上清液，D-Hanks清洗后分離表皮和真皮。表皮剪碎呈糜狀，以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃條件下消化5～10分鐘，用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吹打至懸液，100目尼龍紗網(wǎng)過濾，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液，以培養(yǎng)液重懸制成單細胞懸液。

1.2.2 膠原黏附法選擇表皮干細胞 將單細胞懸液以2×105 個/毫升的密度接種在鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10～15分鐘。吸出細胞懸液，粘附在膠原被膜上的細胞則為表皮干細胞。

1.2.3 表皮干細胞培養(yǎng) 在去除細胞懸液鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶中加入無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基（KSFM）進行培養(yǎng)，12小時后換液以除去未貼壁的細胞，以后每2天換液一次，光學顯微鏡下觀察細胞生長情況。

2 結果與分析

2.1 原代培養(yǎng)的表皮干細胞

剛剛接種的表皮干細胞，細胞均勻分散呈圓形，核大，胞體小，培養(yǎng)一周（圖1）進入增殖期，第12天達到高峰表皮干細胞漸漸伸展形成扁平的多角狀，胞質(zhì)近中央處有圓形核并開始形成小克隆，細胞即連接成片，緊密相靠，相互銜接，呈鋪路石狀，匯合成片。

2.2 傳代培養(yǎng)的表皮干細胞

原代細胞接種24小時后即伸展，相互聚集，粘附在膠原上，呈克隆樣生長，細胞聚集在集落中心周圍呈輻射狀生長，5～6天表皮干細胞增殖能力加強，達到融合鋪滿培養(yǎng)瓶的瓶底。

3 結語

不同的細胞外基質(zhì)對細胞的黏附作用不同，表皮干細胞主要通過表達整合素實現(xiàn)其對基底膜的粘附，同時也是干細胞維持其特性的基本條件。IV型膠原作為細胞外基質(zhì)的主要成分對細胞的粘附、生長、移行等方面起重要作用，表皮干細胞不僅對IV型膠原有較強的粘附性，而且在IV型膠原上能很好的生長，由此進行篩選、培養(yǎng)、純化表皮干細胞，結果表明，獲得的表皮干細胞較純凈，其仍具有較強的分裂增殖能力，于培養(yǎng)后第二天，大量克隆細胞形成，5～6天匯合成片，可以長期傳代。該方法操作簡便，表皮干細胞生長良好，具有較高的克隆形成率。

無血清培養(yǎng)基及其附加的營養(yǎng)成分在細胞生長與培養(yǎng)液之間提供了較好的平衡體系，有利于表皮干細胞的增殖及其表型的維持，由于培養(yǎng)基中不含血清，沒有血清中的各種復雜和不明的成分，排除血清中許多未知因素對干細胞分化的影響，是目前培養(yǎng)表皮干細胞被認可的方法[3]。

參考文獻

[1] 孫曉燕，付小兵，孫同柱.表皮干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定，中華實驗外科雜志[J]，2007，24（2）：163-164.

[2] 王海燕.肺出血·腎炎綜合征抗基底膜抗體型.北京人民衛(wèi)生出版社[M]，1998：912-922.

[3] 劉德伍，陳國安，曹勇，等.人表皮細胞無血清培養(yǎng)的實驗研究[J]，1997，13（6）：419-420.

作者簡介：馮穎，碩士學歷，通化師范學院生命科學學院，講師，研究方向：生物技術。