細胞支原體巢式PCR檢測方法的建立及應用

黃海軍+高其雙+彭霞等

摘要：動物生物制品生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。細胞支原體污染可顯著影響生產用細胞的培養(yǎng)及生物功能的發(fā)揮，最終影響生物制品的生產，給生物制品企業(yè)造成巨大損失，建立高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。建立了一種支原體巢式PCR檢測方法，該方法高效、快速、靈敏，可以最大限度降低假陰性和假陽性結果的出現(xiàn)。該方法的建立對培養(yǎng)細胞、動物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測標準化管理有一定的借鑒意義。

關鍵詞：支原體；細胞培養(yǎng)；巢式PCR；生物制品

中圖分類號：S858.28；Q95 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0690-03

細胞培養(yǎng)過程中支原體污染主要來源于所使用的動物源的一些培養(yǎng)材料，如血清、已被支原體污染的細胞株（系）或者是經操作人員傳播。污染培養(yǎng)細胞的支原體一般有寄生于人、牛、豬或狗的少數(shù)幾種類型。細胞培養(yǎng)液中支原體的濃度可達1×107個/mL，而不管是肉眼觀察還是普通顯微鏡下觀察，受支原體污染的細胞狀態(tài)并無明顯變化[1]。但是，越來越多的研究表明，支原體感染發(fā)生后能改變細胞的DNA、RNA及蛋白表達，使研究結果的真實性和可靠性大大下降[2，3]。由于競爭營養(yǎng)及支原體有毒的代謝產物，支原體污染可顯著影響生產用細胞的培養(yǎng)及相應生物學功能的發(fā)揮，影響生物制品的質量。細胞被支原體污染長期困擾著疫苗（特別是生產弱毒苗）的生產企業(yè)，增加了企業(yè)生產、投資的風險，特別是在競爭日益激烈的當代社會，這種風險對疫苗生產企業(yè)來說通常是致命的。因此，建立一種高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。

目前，普遍公認的細胞支原體污染檢測方法為分離培養(yǎng)法，該方法耗時、敏感性低，甚至可能出現(xiàn)二次污染，影響結果的判斷。隨著分子生物學的發(fā)展，PCR方法已經成為一種常用的有效檢測培養(yǎng)困難和抗原性復雜的微生物的方法[4，5]。本研究建立了一種細胞支原體巢式PCR檢測方法，最大限度降低了假陰性和假陽性結果的出現(xiàn)，以期為完善細胞支原體的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）濟南系強毒（菌號CVCC354）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

供試試劑與儀器：Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5 mmol/L）、DNA凝膠回收與純化試劑盒購自武漢天源生物技術公司，對比用支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）由以色列BI公司生產。9700型PCR 儀由美國ABI公司生產。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據(jù)12種常見類型支原體（M. hyorhinis、M. orale、M. hyopneumoniae、M. arginini、

1.2.2 PCR檢測方法的建立

1）陽性PCR模板的制備：將豬肺炎支原體培養(yǎng)液沸水水浴10 min，再3 000 r/min離心10 min，取上清液作為支原體陽性PCR擴增的陽性模板。

2）陽性支原體的檢測：第一輪PCR反應體系25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，陽性引物Myc-F1和Myc-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，陽性模板1 μL，Taq DNA 酶（2.5 U/μL） 0.25 μL，加ddH2O至25 μL。同時以ddH2O為陰性對照。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。第一輪PCR反應結束后，取1 μL PCR產物作為第二輪PCR反應的模板，反應體系其他成分及反應條件同第一輪PCR。分別取第一輪和第二輪PCR反應產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后對目的片段進行純化，作為PCR陽性模板備用。

3）陽性Mhp模板稀釋倍數(shù)的確定：按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6濃度梯度稀釋Mhp陽性產物，固定體系其他成分不變進行PCR反應。反應結束后，取10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇最適濃度作為Mhp陽性標準品。

4）反應條件的優(yōu)化：Taq DNA 酶最適使用量的確定，按最適引物濃度，優(yōu)化Taq DNA 酶 （2.5 U/μL）的使用量，分別為0.125、0.25、0.5 μL；dNTP最適使用量的確定，反應體系中dNTP（2.5 mmol/L）的使用量分別為1、2、3 μL。反應體系中其他成分和反應條件均不改變。反應結束后，取PCR反應產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定最適濃度配比。

1.2.3 應用 從武漢某疫苗生產車間隨機選取3個批次共10個疑似支原體污染的樣本，收集細胞培養(yǎng)上清液。3 000 r/min離心5 min，沉淀培養(yǎng)液中殘留的細胞，然后取上清液5 μL備用。按本研究建立的巢式PCR反應體系及條件，對各樣本的兩種平行樣品進行檢測。并將結果與EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果進行比對。將兩種方法檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4梯度稀釋，分別用本研究建立的方法和支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）進行檢測，比較兩者的靈敏度。將本方法診斷陽性的樣品進行病原培養(yǎng)，驗證其檢測準確性。

2 結果與分析

2.1 陽性標準品的建立

經PCR擴增得到654 bp的Mhp基因片段，與預期結果相符（圖1）。測定回收的Mhp陽性模板濃度為13.6 μg/mL，結果表明， Mhp陽性模板的稀釋倍數(shù)為1×10-5 時，條帶清晰（圖1），考慮到檢測條件及產物的穩(wěn)定性，將標準品濃度定為2×10-4 μg/mL，即0.2 ng/mL。

2.2 巢式PCR反應體系的優(yōu)化

在反應條件及體系其他成分不變的同時，分別對Taq DNA酶和dNTP使用量進行優(yōu)化，并根據(jù)第一次和第二次PCR擴增結果，確定反應體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測方法的應用

用所建立的巢式PCR檢測方法對收集的10個疑似支原體污染樣品進行檢測，第一輪PCR擴增結果和第二輪擴增結果分別見圖2和圖3。

將PCR產物回收送上海生工生物工程有限公司測序，并與Genbank中登錄的相關序列進行比對，結果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽性，7號樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽性，4號樣品和8號樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽性。該結果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果完全一致。

將4個檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進行檢測，結果表明，2種方法均可檢測到稀釋10-3倍的模板，符合率達100%。

3 小結與討論

支原體是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無細胞壁故具有可塑性，可通過濾菌器，對于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細胞培養(yǎng)污染的一個重要因素[6]。動物疫苗生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。已有許多調查及研究顯示，美國和歐洲正在使用的細胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國微生物和培養(yǎng)細胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內細胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國內使用的細胞系中的支原體的污染更為嚴重，使得生物制品企業(yè)面臨的形勢極為嚴峻[1]。

支原體感染細胞后，并不引起細胞形態(tài)及功能的急性改變，不易被察覺，但是細胞支原體污染卻給疫苗生產帶來致命打擊。因此，在疫苗生產早期對細胞支原體污染進行監(jiān)測具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測支原體的引物選用16S rRNA序列保守區(qū)，難以在保證特異性強的情況下擴增出所有常見支原體污染種別的DNA，導致假陰性結果的出現(xiàn)。本研究根據(jù)常見支原體16S～23S間隔區(qū)種別特異性序列，設計2對用于巢式擴增支原體的引物，可以準確檢測12種常見支原體，這12種常見支原體代表了98%以上的細胞支原體污染源。本方法檢測整個過程耗時不超過6 h，且設置了陰性對照和陽性對照標準品，避免了假陰性和假陽性，檢測結果與以色列BI公司支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結果相一致，也證實了其檢測的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細胞培養(yǎng)、動物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測標準化管理中得到廣泛應用。

參考文獻：

[1] 劉玉琴.體外培養(yǎng)細胞工作中支原體污染及對策[J].中華病理學雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悅，呂允威，張春鳳，等.細胞系中支原體檢測及分型[J].北京大學學報（醫(yī)學版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王銀銀，任芳麗，等.培養(yǎng)細胞污染支原體的PCR檢測方法的建立及應用[J].中國醫(yī)藥生物技術，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反應體系的優(yōu)化

在反應條件及體系其他成分不變的同時，分別對Taq DNA酶和dNTP使用量進行優(yōu)化，并根據(jù)第一次和第二次PCR擴增結果，確定反應體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測方法的應用

用所建立的巢式PCR檢測方法對收集的10個疑似支原體污染樣品進行檢測，第一輪PCR擴增結果和第二輪擴增結果分別見圖2和圖3。

將PCR產物回收送上海生工生物工程有限公司測序，并與Genbank中登錄的相關序列進行比對，結果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽性，7號樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽性，4號樣品和8號樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽性。該結果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果完全一致。

將4個檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進行檢測，結果表明，2種方法均可檢測到稀釋10-3倍的模板，符合率達100%。

3 小結與討論

支原體是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無細胞壁故具有可塑性，可通過濾菌器，對于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細胞培養(yǎng)污染的一個重要因素[6]。動物疫苗生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。已有許多調查及研究顯示，美國和歐洲正在使用的細胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國微生物和培養(yǎng)細胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內細胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國內使用的細胞系中的支原體的污染更為嚴重，使得生物制品企業(yè)面臨的形勢極為嚴峻[1]。

支原體感染細胞后，并不引起細胞形態(tài)及功能的急性改變，不易被察覺，但是細胞支原體污染卻給疫苗生產帶來致命打擊。因此，在疫苗生產早期對細胞支原體污染進行監(jiān)測具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測支原體的引物選用16S rRNA序列保守區(qū)，難以在保證特異性強的情況下擴增出所有常見支原體污染種別的DNA，導致假陰性結果的出現(xiàn)。本研究根據(jù)常見支原體16S～23S間隔區(qū)種別特異性序列，設計2對用于巢式擴增支原體的引物，可以準確檢測12種常見支原體，這12種常見支原體代表了98%以上的細胞支原體污染源。本方法檢測整個過程耗時不超過6 h，且設置了陰性對照和陽性對照標準品，避免了假陰性和假陽性，檢測結果與以色列BI公司支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結果相一致，也證實了其檢測的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細胞培養(yǎng)、動物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測標準化管理中得到廣泛應用。

參考文獻：

[1] 劉玉琴.體外培養(yǎng)細胞工作中支原體污染及對策[J].中華病理學雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悅，呂允威，張春鳳，等.細胞系中支原體檢測及分型[J].北京大學學報（醫(yī)學版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王銀銀，任芳麗，等.培養(yǎng)細胞污染支原體的PCR檢測方法的建立及應用[J].中國醫(yī)藥生物技術，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反應體系的優(yōu)化

在反應條件及體系其他成分不變的同時，分別對Taq DNA酶和dNTP使用量進行優(yōu)化，并根據(jù)第一次和第二次PCR擴增結果，確定反應體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測方法的應用

用所建立的巢式PCR檢測方法對收集的10個疑似支原體污染樣品進行檢測，第一輪PCR擴增結果和第二輪擴增結果分別見圖2和圖3。

將PCR產物回收送上海生工生物工程有限公司測序，并與Genbank中登錄的相關序列進行比對，結果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽性，7號樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽性，4號樣品和8號樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽性。該結果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測結果完全一致。

將4個檢測為陽性的樣品依次進行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進行檢測，結果表明，2種方法均可檢測到稀釋10-3倍的模板，符合率達100%。

3 小結與討論

支原體是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無細胞壁故具有可塑性，可通過濾菌器，對于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細胞培養(yǎng)污染的一個重要因素[6]。動物疫苗生產過程中細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。已有許多調查及研究顯示，美國和歐洲正在使用的細胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國微生物和培養(yǎng)細胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內細胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國內使用的細胞系中的支原體的污染更為嚴重，使得生物制品企業(yè)面臨的形勢極為嚴峻[1]。

支原體感染細胞后，并不引起細胞形態(tài)及功能的急性改變，不易被察覺，但是細胞支原體污染卻給疫苗生產帶來致命打擊。因此，在疫苗生產早期對細胞支原體污染進行監(jiān)測具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測支原體的引物選用16S rRNA序列保守區(qū)，難以在保證特異性強的情況下擴增出所有常見支原體污染種別的DNA，導致假陰性結果的出現(xiàn)。本研究根據(jù)常見支原體16S～23S間隔區(qū)種別特異性序列，設計2對用于巢式擴增支原體的引物，可以準確檢測12種常見支原體，這12種常見支原體代表了98%以上的細胞支原體污染源。本方法檢測整個過程耗時不超過6 h，且設置了陰性對照和陽性對照標準品，避免了假陰性和假陽性，檢測結果與以色列BI公司支原體PCR檢測試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結果相一致，也證實了其檢測的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細胞培養(yǎng)、動物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測標準化管理中得到廣泛應用。

參考文獻：

[1] 劉玉琴.體外培養(yǎng)細胞工作中支原體污染及對策[J].中華病理學雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悅，呂允威，張春鳳，等.細胞系中支原體檢測及分型[J].北京大學學報（醫(yī)學版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王銀銀，任芳麗，等.培養(yǎng)細胞污染支原體的PCR檢測方法的建立及應用[J].中國醫(yī)藥生物技術，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.