蓮藕愈傷組織誘導及組織學觀察

李佳+趙文龍+周長艷+王震宇

摘要：以蓮藕（Nelumba nucifera）的頂芽和側(cè)芽為外植體，接種于不同外源激素配比的MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導。結(jié)果表明，愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA+0.20% Gelrite，誘導率在20%以上，且愈傷組織狀態(tài)良好，顏色淡黃色至黃褐色，生長量較大。其中，2，4-D在蓮藕愈傷組織誘導中起重要作用。從組織學切片的顯微觀察結(jié)果分析，單寧類物質(zhì)可能是導致蓮藕愈傷組織誘導過程中極易褐化的重要因素之一。以Gelrite代替瓊脂粉作為固化劑，可明顯改善外植體的褐化現(xiàn)象。

關鍵詞：蓮藕（Nelumba nucifera）；愈傷組織；單寧；褐化

中圖分類號：S645.1；Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0701-03

蓮藕（Nelumba nucifera）為睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo）多年生大型水生草本植物，是雙子葉植物的較低級種，原產(chǎn)于中國和印度，在中國栽培歷史悠久[1]。在自然選擇和人工選擇中，產(chǎn)生很多變異，因而種質(zhì)資源豐富。蓮藕營養(yǎng)豐富，含淀粉、蛋白質(zhì)、糖、維生素等多種營養(yǎng)成分，營養(yǎng)價值較高[2]。然而，由于蓮藕主要以塊莖進行無性繁殖，多年反復栽培后，種質(zhì)容易退化。此外，以常規(guī)方法進行蓮藕的繁育，繁殖率低、用種量大、生產(chǎn)成本較高，且病毒病、褐斑病、腐敗病等病害易發(fā)生，給蓮藕的制種和品質(zhì)改良帶來了的困難，使其產(chǎn)量和質(zhì)量受到影響[3]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行蓮藕的培養(yǎng)可提高其無性繁殖率，并保持良好的遺傳穩(wěn)定性[4]。本試驗以蓮藕頂芽及側(cè)芽為材料進行愈傷組織誘導，并對其發(fā)生過程進行了組織學觀察，對愈傷組織的發(fā)生機理進行了初步研究，為蓮藕的種質(zhì)保存及品種改良奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蓮藕品種為鄂蓮五號“3735”（品種號），由湖北省武漢市東西湖區(qū)吳家山西湖大隊提供。于2010年3至4月栽種期取藕頭飽滿、頂芽完整的種藕為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導

1）材料處理。選取蓮藕頂芽與側(cè)芽，將其外部葉片剝?nèi)ィ谧詠硭聸_洗干凈，然后在無菌條件下用75%的乙醇消毒30 s，隨即放入0.1%升汞溶液中處理15 min，用無菌水漂洗4次，橫切成0.3 ～ 0.5 cm3的外植體，接種到培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

2）愈傷組織誘導培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，pH調(diào)至5.8～6.0，蔗糖3%，添加不同濃度水平的6-BA、NAA、2，4-D、瓊脂粉或Gelrite、活性炭，組成愈傷組織誘導培養(yǎng)基，以這5個因素，每因素4個水平進行L16（45）正交試驗，試驗因素和水平見表1。

3）培養(yǎng)條件。溫度為（25±2） ℃，避光培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織發(fā)生過程的組織學觀察 接種后，每隔10 d取具有代表性的樣品組織塊，F(xiàn)AA固定液固定24 h，70%乙醇∶冰醋酸為3∶1（V/V）的溶液中保存。材料收集齊后，用70%乙醇將酸洗凈，經(jīng)乙醇/二甲苯系列脫水后，石蠟包埋，石蠟切片機切片，厚度10 μm，切片脫蠟復水后采用蘇木精染色法染色，乙醇系列脫水后二甲苯透明，中性樹膠永久封片[5]。采用光學顯微鏡鏡檢拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配比對蓮藕愈傷組織誘導的影響

將蓮藕頂芽和側(cè)芽橫切成0.3～0.5 cm3的外植體，按照表1所示的正交試驗，接種在不同濃度配比的愈傷組織培養(yǎng)基中誘導，10 d左右可見外植體組織膨大，30 d左右開始形成愈傷組織（圖1），50 d左右大量愈傷組織形成，此時若不及時更換培養(yǎng)基，組織則極易褐化死亡。將50 d時愈傷組織的誘導情況進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，不同成分配比的培養(yǎng)基對蓮藕莖尖的愈傷組織誘導有較大的影響。

正交試驗結(jié)果（表2）表明，從愈傷組織誘導率的結(jié)果來看，13號試驗的效果最好，達到36.67%，其次為7號試驗，結(jié)果為33.33%。通過比較極差R值的大小，對愈傷組織誘導率的影響由大到小的因素為2，4-D、固化劑、6-BA、活性炭、NAA。表明2，4-D的濃度水平的變化對蓮藕愈傷組織的誘導起主導作用，其極差可達25.000；且隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織誘導率也明顯增加。其次為固化劑的影響，添加Gelrite比添加瓊脂粉對愈傷組織的誘導更有利，然而并不是濃度越高效果越好，其最佳濃度為0.2%。6-BA的添加也對愈傷組織的誘導起到明顯作用，其R值為8.335?；钚蕴亢蚇AA對愈傷組織誘導率的影響不大，其極差分別為7.500和5.829。

愈傷組織誘導50 d左右的情況見表2。當2，4-D濃度增高時，雖然愈傷組織誘導率明顯增加，但形態(tài)上逐漸出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)狀愈傷，此類愈傷組織很難分化成苗，因此，選擇2.0或4.0 mg/L的2，4-D對于愈傷組織的誘導更為有利。此外，若2，4-D濃度較高并同時添加較高濃度6-BA時，則伴有少量硬塊出現(xiàn)，所以6-BA的濃度也不宜過高。NAA對愈傷組織誘導率的影響不大，然而添加一定量的NAA有助于愈傷組織的誘導，當添加較低濃度的NAA時，愈傷組織的生長量有所增加，顏色由淡黃色變?yōu)辄S色。固化劑對愈傷組織的誘導同樣有較大的影響。當以瓊脂粉為固化劑時，愈傷組織普遍呈現(xiàn)暗黃色，易褐化，生長量也較少；若同時添加活性炭，褐化現(xiàn)象有所改善；當以Gelrite為固化劑時，愈傷組織顏色變淺，褐化現(xiàn)象明顯減少，生長量也普遍增加。

綜合愈傷組織誘導率和誘導狀態(tài)的結(jié)果分析，得到誘導蓮藕愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2，4-D+ 0.1 mg/L NAA+0.20% Gelrite。采用該培養(yǎng)基配方進行驗證試驗，愈傷組織誘導情況較為理想，誘導率普遍在20%以上，且愈傷組織狀態(tài)良好，顏色為淡黃色至黃褐色，生長量較大。

2.2 蓮藕愈傷組織誘導過程的組織學觀察

采用正交試驗得到的最佳培養(yǎng)基配方誘導蓮藕愈傷組織，外植體接種后，每隔10 d取樣1次，制片拍照，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)10 d左右，可見細胞核染色加深，核質(zhì)比增大，細胞開始活躍分裂（圖2a）；培養(yǎng)30 d左右，細胞內(nèi)容物染色加深，細胞質(zhì)濃厚，細胞分裂旺盛，愈傷組織形成，并出現(xiàn)少量單寧細胞（圖2b）；培養(yǎng)50 d左右，可見大量細碎的染色較深的細胞，內(nèi)部出現(xiàn)大量無規(guī)則的維管束（圖2c），此時應及時轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，若不及時轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)到60 d，則結(jié)構(gòu)變得疏松，且出現(xiàn)大量染色很深的單寧細胞（圖2d），此時，愈傷組織極易褐化死亡。

3 討論

在蓮藕組織培養(yǎng)過程中，污染比較嚴重，可能是蓮藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒滅菌過程中不容易被消滅，因此造成組織培養(yǎng)過程中較為嚴重的污染情況?？梢圆扇∫欢ǖ姆椒p少類似情況發(fā)生，比如取材要新鮮，切取頂芽或側(cè)芽時盡量不要損傷芽體，以免暴露內(nèi)部的空隙。

此外，褐化問題一直是蓮藕組織培養(yǎng)過程中普遍存在的現(xiàn)象。分析原因，與蓮藕中多酚氧化酶（PPO）活性較高有關[6，7]。切取的外植體在接觸氧氣后，切口處多酚類物質(zhì)在PPO的作用下，氧化成醌，導致蓮藕褐化，積累較多時，對外植體產(chǎn)生毒害[8]。從組織切片觀察結(jié)果看，單寧類物質(zhì)隨著培養(yǎng)的時間加長而增加，而單寧是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈傷組織誘導過程中發(fā)現(xiàn)隨著單寧物質(zhì)含量的減少，愈傷組織形成部位向切口上移，說明單寧的存在可抑制愈傷組織的發(fā)生，本試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)時間越長，單寧含量越高，組織越容易褐化，愈傷組織的產(chǎn)生越少，因此分析單寧是導致蓮藕極易褐化的主要原因之一。本試驗中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。其中比較有效的方法包括及時繼代，減少培養(yǎng)時間，可一定程度上減緩單寧物質(zhì)的影響；另外，在培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌類，有效控制褐化現(xiàn)象，然而活性炭同時也吸附了其他的營養(yǎng)物質(zhì)，對愈傷組織的生長和增殖有一定影響。因此，在培養(yǎng)初期采用活性炭，到后期組織情況穩(wěn)定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代瓊脂作為固化劑可明顯改善褐化情況，分析原因，可能是由于Gelrite成分更為純凈，在固化效果相同的情況下，用量少，一般僅為瓊脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化劑滲透性強，使產(chǎn)生的醌更快擴散。

此外，蓮藕的愈傷組織誘導率較低，一般最高僅為30%左右，相應的類似報道也不多見，刁英等[10]報道的蓮藕愈傷誘導結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高誘導率可達32%，誘導率同樣較低。因此，要達到實際生產(chǎn)的要求，還需要進一步研究更加適合的培養(yǎng)方案。

參看文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1994.646.

[2] 張建福，王 鋒.蓮藕的組織培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2000（4）：10.

[3] 陳麗萍，周可明，張志友.蓮藕組織培養(yǎng)研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韓延闖，何建軍，等.蓮藕研究進展[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技術(shù)[M].北京：科學出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，張長遠.植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機理及克服方法[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2001（3）：16-18.

[7] 陳桂芳，婁利華.植物組織培養(yǎng)中幾個常見的技術(shù)問題[J].重慶林業(yè)科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家順，李 鵬.蓮藕多酚氧化酶的催化特性檢測[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望儀，黃堅欽，等.山核桃愈傷組織誘導的初步研究[J].浙江林學院學報，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吳金平，趙玲玲，等.蓮胚性愈傷組織誘導研究初報[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（14）：2991-2992.

2.2 蓮藕愈傷組織誘導過程的組織學觀察

采用正交試驗得到的最佳培養(yǎng)基配方誘導蓮藕愈傷組織，外植體接種后，每隔10 d取樣1次，制片拍照，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)10 d左右，可見細胞核染色加深，核質(zhì)比增大，細胞開始活躍分裂（圖2a）；培養(yǎng)30 d左右，細胞內(nèi)容物染色加深，細胞質(zhì)濃厚，細胞分裂旺盛，愈傷組織形成，并出現(xiàn)少量單寧細胞（圖2b）；培養(yǎng)50 d左右，可見大量細碎的染色較深的細胞，內(nèi)部出現(xiàn)大量無規(guī)則的維管束（圖2c），此時應及時轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，若不及時轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)到60 d，則結(jié)構(gòu)變得疏松，且出現(xiàn)大量染色很深的單寧細胞（圖2d），此時，愈傷組織極易褐化死亡。

3 討論

在蓮藕組織培養(yǎng)過程中，污染比較嚴重，可能是蓮藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒滅菌過程中不容易被消滅，因此造成組織培養(yǎng)過程中較為嚴重的污染情況?？梢圆扇∫欢ǖ姆椒p少類似情況發(fā)生，比如取材要新鮮，切取頂芽或側(cè)芽時盡量不要損傷芽體，以免暴露內(nèi)部的空隙。

此外，褐化問題一直是蓮藕組織培養(yǎng)過程中普遍存在的現(xiàn)象。分析原因，與蓮藕中多酚氧化酶（PPO）活性較高有關[6，7]。切取的外植體在接觸氧氣后，切口處多酚類物質(zhì)在PPO的作用下，氧化成醌，導致蓮藕褐化，積累較多時，對外植體產(chǎn)生毒害[8]。從組織切片觀察結(jié)果看，單寧類物質(zhì)隨著培養(yǎng)的時間加長而增加，而單寧是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈傷組織誘導過程中發(fā)現(xiàn)隨著單寧物質(zhì)含量的減少，愈傷組織形成部位向切口上移，說明單寧的存在可抑制愈傷組織的發(fā)生，本試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)時間越長，單寧含量越高，組織越容易褐化，愈傷組織的產(chǎn)生越少，因此分析單寧是導致蓮藕極易褐化的主要原因之一。本試驗中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。其中比較有效的方法包括及時繼代，減少培養(yǎng)時間，可一定程度上減緩單寧物質(zhì)的影響；另外，在培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌類，有效控制褐化現(xiàn)象，然而活性炭同時也吸附了其他的營養(yǎng)物質(zhì)，對愈傷組織的生長和增殖有一定影響。因此，在培養(yǎng)初期采用活性炭，到后期組織情況穩(wěn)定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代瓊脂作為固化劑可明顯改善褐化情況，分析原因，可能是由于Gelrite成分更為純凈，在固化效果相同的情況下，用量少，一般僅為瓊脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化劑滲透性強，使產(chǎn)生的醌更快擴散。

此外，蓮藕的愈傷組織誘導率較低，一般最高僅為30%左右，相應的類似報道也不多見，刁英等[10]報道的蓮藕愈傷誘導結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高誘導率可達32%，誘導率同樣較低。因此，要達到實際生產(chǎn)的要求，還需要進一步研究更加適合的培養(yǎng)方案。

參看文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1994.646.

[2] 張建福，王 鋒.蓮藕的組織培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2000（4）：10.

[3] 陳麗萍，周可明，張志友.蓮藕組織培養(yǎng)研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韓延闖，何建軍，等.蓮藕研究進展[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技術(shù)[M].北京：科學出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，張長遠.植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機理及克服方法[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2001（3）：16-18.

[7] 陳桂芳，婁利華.植物組織培養(yǎng)中幾個常見的技術(shù)問題[J].重慶林業(yè)科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家順，李 鵬.蓮藕多酚氧化酶的催化特性檢測[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望儀，黃堅欽，等.山核桃愈傷組織誘導的初步研究[J].浙江林學院學報，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吳金平，趙玲玲，等.蓮胚性愈傷組織誘導研究初報[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（14）：2991-2992.

2.2 蓮藕愈傷組織誘導過程的組織學觀察

采用正交試驗得到的最佳培養(yǎng)基配方誘導蓮藕愈傷組織，外植體接種后，每隔10 d取樣1次，制片拍照，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)10 d左右，可見細胞核染色加深，核質(zhì)比增大，細胞開始活躍分裂（圖2a）；培養(yǎng)30 d左右，細胞內(nèi)容物染色加深，細胞質(zhì)濃厚，細胞分裂旺盛，愈傷組織形成，并出現(xiàn)少量單寧細胞（圖2b）；培養(yǎng)50 d左右，可見大量細碎的染色較深的細胞，內(nèi)部出現(xiàn)大量無規(guī)則的維管束（圖2c），此時應及時轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，若不及時轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)到60 d，則結(jié)構(gòu)變得疏松，且出現(xiàn)大量染色很深的單寧細胞（圖2d），此時，愈傷組織極易褐化死亡。

3 討論

在蓮藕組織培養(yǎng)過程中，污染比較嚴重，可能是蓮藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒滅菌過程中不容易被消滅，因此造成組織培養(yǎng)過程中較為嚴重的污染情況?？梢圆扇∫欢ǖ姆椒p少類似情況發(fā)生，比如取材要新鮮，切取頂芽或側(cè)芽時盡量不要損傷芽體，以免暴露內(nèi)部的空隙。

此外，褐化問題一直是蓮藕組織培養(yǎng)過程中普遍存在的現(xiàn)象。分析原因，與蓮藕中多酚氧化酶（PPO）活性較高有關[6，7]。切取的外植體在接觸氧氣后，切口處多酚類物質(zhì)在PPO的作用下，氧化成醌，導致蓮藕褐化，積累較多時，對外植體產(chǎn)生毒害[8]。從組織切片觀察結(jié)果看，單寧類物質(zhì)隨著培養(yǎng)的時間加長而增加，而單寧是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈傷組織誘導過程中發(fā)現(xiàn)隨著單寧物質(zhì)含量的減少，愈傷組織形成部位向切口上移，說明單寧的存在可抑制愈傷組織的發(fā)生，本試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)時間越長，單寧含量越高，組織越容易褐化，愈傷組織的產(chǎn)生越少，因此分析單寧是導致蓮藕極易褐化的主要原因之一。本試驗中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。其中比較有效的方法包括及時繼代，減少培養(yǎng)時間，可一定程度上減緩單寧物質(zhì)的影響；另外，在培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌類，有效控制褐化現(xiàn)象，然而活性炭同時也吸附了其他的營養(yǎng)物質(zhì)，對愈傷組織的生長和增殖有一定影響。因此，在培養(yǎng)初期采用活性炭，到后期組織情況穩(wěn)定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代瓊脂作為固化劑可明顯改善褐化情況，分析原因，可能是由于Gelrite成分更為純凈，在固化效果相同的情況下，用量少，一般僅為瓊脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化劑滲透性強，使產(chǎn)生的醌更快擴散。

此外，蓮藕的愈傷組織誘導率較低，一般最高僅為30%左右，相應的類似報道也不多見，刁英等[10]報道的蓮藕愈傷誘導結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高誘導率可達32%，誘導率同樣較低。因此，要達到實際生產(chǎn)的要求，還需要進一步研究更加適合的培養(yǎng)方案。

參看文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1994.646.

[2] 張建福，王 鋒.蓮藕的組織培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2000（4）：10.

[3] 陳麗萍，周可明，張志友.蓮藕組織培養(yǎng)研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韓延闖，何建軍，等.蓮藕研究進展[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技術(shù)[M].北京：科學出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，張長遠.植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機理及克服方法[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2001（3）：16-18.

[7] 陳桂芳，婁利華.植物組織培養(yǎng)中幾個常見的技術(shù)問題[J].重慶林業(yè)科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家順，李 鵬.蓮藕多酚氧化酶的催化特性檢測[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望儀，黃堅欽，等.山核桃愈傷組織誘導的初步研究[J].浙江林學院學報，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吳金平，趙玲玲，等.蓮胚性愈傷組織誘導研究初報[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（14）：2991-2992.