巴西橡膠樹PEPRK基因家族成員的鑒定和表達分析

肖小虎 隋金蕾 戚繼艷 方永軍 周斌輝 唐朝榮

摘 要 PEP羧化酶激酶相關激酶（PEP carboxylase kinase-related kinases，PEPRKs）是CDPK-SnRK超家族的一員，目前對其生理功能尚不清楚。本研究以擬南芥和楊樹的PEPRK序列作為探針，對橡膠樹和其他5種植物（木薯、水稻、楊樹、蓖麻和擬南芥）的基因組和轉錄組數據進行全面搜索，共鑒定得到25個PEPRK基因家族成員，其中包括5個橡膠樹PEPRK基因，命名為HbPEPRK1-5。序列分析發(fā)現橡膠樹PEPRK和其他植物類似，在序列中部含有一個相對比較保守的激酶結構域，而兩端的同源性相對較低。在基因結構和進化方面，PEPRK主要分為2個大的分支，相同分支的成員在結構域和內含子分布上更為相似，其中橡膠樹和木薯PEPRK在進化上具有較近的親緣關系。在基因的表達方面，HbPEPRK1主要在穩(wěn)定期的葉片中表達，HbPEPRK2和HbPEPRK5在樹葉、樹皮和膠乳中均有表達，HbPEPRK4主要在種子中表達；另外，研究發(fā)現橡膠樹PEPRK家族成員的表達還與葉片發(fā)育、乙烯利刺激、真菌侵染和低溫脅迫具有一定的相關性。

關鍵詞 巴西橡膠樹；PEPRK；基因家族；結構與進化；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Identification and Expression of PEPRK Genes

from Hevea brasliensis

XIAO Xiaohu1， SUI Jinlei1，2， QI Jiyan1， FANG Yongjun1，

ZHOU Binhui1，2， TANG Chaorong1*

1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase-related kinase is a member of CDPK-SnRK superfamily. Little is known about its functions. By searching the transcriptome and genome databases， we have identified 25 PEPRK genes from Hevea brasliensis and five other plant species， including five members from H. brasliensis， which were named HbPEPRK1 to 5. Sequence analysis revealed that all PEPRK genes comprised one protein kinase domain. The plant PEPRK clustered into two major groups in phylogenetic tree， the members in the same group shared a similar introns and domains distribution. H. brasliensis PEPRKs were more closely related to PEPRKs of Manihot esculenta. The results of expression analysis indicated that HbPEPRK1 was mainly expressed in mature leaves， HbPEPRK2 and HbPEPRK5 were expressed in leaves， bark and latex， HbPEPRK4 was mainly expressed in seeds. In addition， the expression of H. brasliensis PEPRK genes was related to leaf development， ethephon stimulation， C. cassiicola infection and low temperature.

Key words Hevea brasiliensis； PEPRK； gene family； structure and evolution； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.013

在植物中，CDPK-SnRK超家族包含7種絲氨酸-蘇氨酸蛋白蛋白激酶：鈣依賴蛋白激酶（Ca2+-dependent protein kinases，CDPKs），CDPK相關蛋白激酶（CDPK-related kinases，CRKs），磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxylase kinases，PPCKs），PEP羧化酶激酶相關激酶（PEP carboxylase kinase-related kinases，PEPRKs），鈣調素依賴性蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinases，CaMKs），鈣/鈣調素依賴型蛋白激酶（calcium and calmodulin-dependent protein kinases，CCaMKs）和SnRKs蛋白激酶[1]。PEPRKs是與CDPK高度同源和密切相關的一類絲/蘇蛋白激酶，僅存在于植物體內，關于其功能研究報道較少[1-3]。在橡膠樹中，李超燕等[4]根據EST序列利用RACE從橡膠樹中克隆得到一個PEPRK基因，命名為HbPEPRK1，并利用熒光定量PCR技術對其表達進行了初步分析。本研究以已發(fā)表[1，3]PEPRK蛋白氨基酸序列為探針，對橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻6種植物的全基因組數據進行全面搜索，鑒定得到25個PEPRK基因家族成員，其中橡膠樹中有5個。筆者們利用相關軟件和數據庫，對橡膠樹PEPRK基因家族成員的基因結構、進化和表達水平進行了系統(tǒng)分析。研究結果將有助于本課題組深入了解橡膠樹PEPRK的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室Solexa測序所用的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）熱研7-33-97材料，除了根來自于組培苗外，其他組織（包括膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花）均來自中國熱帶農業(yè)科學院試驗場3隊的正常割膠橡膠樹（開割2 a以上），根來自于中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所種質資源圃華玉偉老師贈送的熱研7-33-9組培苗；不同發(fā)育時期的橡膠樹葉片來自于中國熱帶農業(yè)科學院橡膠所種質資源圃，為一年生的熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要來自于海南省儋州市中國熱帶農業(yè)科學院試驗場3隊，品系為熱研7-33-9，正常開割樹（3天一刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同時間處理橡膠樹，相應4個時間點處理為0、3、12、24 h。

網上測序數據來自NCBI SRA數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），包括不同組織（PRJNA201084），真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance，PRJNA179126）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078）和乙烯利處理（PRJNA182079），詳細信息參見數據庫中實驗說明。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析 為了全面鑒定橡膠樹、擬南芥、楊樹、水稻、木薯和蓖麻的PEPRK基因家族成員，本課題組從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數據庫下載了5種植物的基因組和轉錄組數據。以擬南芥和楊樹的PEPRK序列為探針，對6種植物的基因組和轉錄組進行搜索，得到候選PEPRK基因家族成員，利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對候選基因的結構域進行分析。再利用EMBOSS數據庫的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_ pepstats/）對基因的等電點和分子量進行批量分析。

1.2.2 基因結構與進化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對橡膠樹和其他5種植物PEPRK基因家族成員的外顯子/內含子組織結構進行分析。利用MEGA 6.0軟件對橡膠樹和其他5種植物的PEPRK氨基酸序列一起構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining方法進行分子系統(tǒng)學分析，進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。

1.2.3 基因的表達模式分析 利用本實驗室和NCBI的solexa轉錄組數據對橡膠樹PEPRK基因家族成員的表達模式進行分析[5]。首先，將NCBI的SRA數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中橡膠樹相關的solexa轉錄組數據下載到本地服務器，去除低質量序列，利用程序RSEM進行表達分析[6]。

2 結果與分析

2.1 PEPRK基因的鑒定與序列分析

通過本地BLAST搜索各植物轉錄組和基因組數據，從橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻6種植物中共鑒定得到25個PEPRK（表1），其中橡膠樹5個，命名為HbPEPRK1-5。通過序列分析發(fā)現，橡膠樹PEPRK蛋白為371～522個氨基酸，分子量為42～57 ku，等電點在5.0～8.8之間，內含子數目為2～3個。氨基酸序列多序列比對發(fā)現，橡膠樹PEPRK蛋白都含有蛋白激酶保守結構域（圖1）。

2.2 基因結構和進化分析

基因外顯子/內含子組織結構和進化分析發(fā)現（圖2），6種植物PPCK家族成員在進化上分為2個較大的分支。在第一個分支，除了RcPEPRK1含有4個內含子，OsPEPRK1、PtPEPRK2和PtPEPRK3含有2個內含子，其他成員均只含有3個內含子；第二個分支中，除了RcPEPRK3含有4個內含子，其他成員均只含有2個內含子，與第一個分支相比第二個分支各成員第一個外顯子要長，蛋白激酶結構域的位置更居中一些。在進化上，橡膠樹和木薯、蓖麻的PEPRK聚在一起，具有較近的親緣關系。另外，部分家族成員成對聚在一起，如HbPEPRK2和HbPEPRK3、PtPEPRK2和PtPEPRK3、PtPEPRK5和PtPEPRK6，說明這些成員之間具有更高的同源性，但部分基因對的表達卻存在明顯差異，如HbPEPRK2和HbPEPRK3（圖3和圖4）。

2.3 橡膠樹PEPRK基因家族成員的表達分析

本實驗室Solexa轉錄組數據的分析結果表明（圖3），HbPEPRK1主要在葉片和膠乳中表達，并且在葉片發(fā)育過程中表達豐度明顯上升，穩(wěn)定期達到最高；HbPEPRK2主要在樹葉、樹皮和膠乳中均有表達，在其他組織中的表達豐度偏低，乙烯利刺激后表達豐度明顯升高，24 h后達到最高；HbPEPRK5主要在葉片和膠乳中表達，在樹皮和花中也有表達，但表達豐度相對較低，乙烯利刺激后表達豐度明顯升高；另外HbPEPRK4主要在種子中表達，在穩(wěn)定期葉片中也有表達；HbPEPRK3在各組織中表達都較低或不表達。

本課題組還利用NCBI的SRA數據庫中的轉錄組數據對橡膠樹PEPRK的表達進行了分析（圖4）。分析結果表明，HbPEPRK1主要在膠乳和葉片中表達，干旱和乙烯利刺激都會不同程度的誘導HbPEPRK1表達；HbPEPRK2主要在膠乳中表達，C. cassiicola侵染會一定程度上誘導其表達；HbPEPRK5主要在膠乳中表達，C. cassiicola侵染和低溫處理會降低其表達，而乙烯利刺激會誘導其表達；另外HbPEPRK3在各組織中表達都比較低，低溫處理會降低其表達；HbPEPRK4同樣在各組織中表達都較低，而低溫和乙烯利處理會誘導其表達。

從以上2部分實驗數據的結果來看，部分家族成員的表達具有普遍性，如HbPEPRK2在各組織都表達；有些成員在個各組織中表達都很低或不表達，如HbPEPRK3；還有一些成員組織特異性表達，如HbPEPRK4主要在種子中表達，在其他組織的表達都很低。另外，通過2部分數據的比較來看，大部分數據結果是一致的，這說明本實驗結果的可靠性，也有些結果有些差異，如HbPEPRK1在樹葉和膠乳中的表達，2部分數據結果存在一定的差異，這可能和材料的種類或采集時間有一定的關系，需要后續(xù)實驗進一步驗證。

3 討論

PEPRK是CDPK-SnRK超家族的一員，與CDPK有較高的同源性，但對其功能的研究相對CDPK來說要少很多。已有研究表明，CDPK在植物生長發(fā)育和逆境脅迫應答等方面起著重要作用[7-10]，PEPRK是否具有類似功能目前尚不清楚。在橡膠樹中，李超燕等[4]利用RACE克隆得到一個PEPRK基因，通過比對發(fā)現該基因和本研究的HbPEPRK5為同一基因。本研究利用高通量測序數據表達分析的結果和李超燕等[4]的結果基本一致，均為在膠乳中表達豐度較高，但乙烯利刺激的結果卻稍有不同，本研究中在0～24 h HbPEPRK5的表達有明顯的遞增趨勢，而李超燕等[4]的結果是在3 h上升到最高然后下降。在本研究中，HbPEPRK1主要在穩(wěn)定期的葉片中表達，HbPEPRK2和HbPEPRK5在樹葉、樹皮和膠乳中均有表達，HbPEPRK4主要在種子中表達；乙烯利刺激刺激后所有家族成員的表達都表現出一定的上升趨勢，說明橡膠樹PEPRK基因可能參與橡膠樹乙烯信號傳導相關反應。另外，研究發(fā)現橡膠樹PEPRK還與葉片發(fā)育、真菌侵染和低溫脅迫具有一定的相關性。本實驗室的高通量數據已成功應用于橡膠樹基因組數據分析以及橡膠樹蔗糖合成酶基因家族相關分析，相關結果發(fā)表在Nature Plants[11]和Febs Journal[5]，這進一步證實了本文數據結果的可靠性。本研究首次從橡膠樹、木薯和蓖麻全基因組中鑒定出PEPRK所有基因家族成員，并利用相關軟件和數據庫對橡膠樹PEPRK各家族成員的基因結構、進化和表達模式進行了全面系統(tǒng)的分析，研究結果將為進一步研究PEPRK在橡膠樹生長發(fā)育和逆境脅迫應答等方面的功能打下基礎。

參考文獻

[1] Hrabak E M， Chan C W M， Michael G， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases[J]. Plant Physiology， 2003， 132（2）： 666-680.

[2] Singh U M， Chandra M， Shankhdhar S C， et al. Transcriptome wide identification and validation of calcium sensor gene family in the developing spikes of finger millet genotypes for elucidating its role in grain calcium accumulation[J]. Plos One， 2014， 9（8）： e103 963-103 963.

[3] Zuo R， Hu R B， Chai G H， et al. Genome-wide identification， classification， and expression analysis of CDPK and its closely related gene families in poplar（Populus trichocarpa）[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 40（3）： 2 645-2 662.

[4] 李超燕， 朱家紅， 徐 靖， 等. 巴西橡膠樹HbPEPRK1的克隆和表達分析[J]. 基因組學與應用生物學， 2015， 34（10）： 2 181-2 186.

[5] Xiao X H， Tang C R， Fang Y J， et al. Structure and expression profile of the sucrose synthase gene family in the rubber tree： indicative of roles in stress response and sucrose utilization in the laticifers[J]. Febs Journal， 2014， 281（1）： 291-305.

[6] Li B， Dewey C N. RSEM： accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics， 2011， 12（1）： 93-99.

[7] Kong X P， Lv W， Jiang S S， et al. Genome-wide identification and expression analysis of calcium-dependent protein kinase in maize[J]. Bmc Genomics， 2013， 14（1）： 447-450.

[8] Ray S， Agarwal P， Arora R， et al. Expression analysis of calcium-dependent protein kinase gene family during reproductive development and abiotic stress conditions in rice （Oryza sativa L. ssp. indica）[J]. Molecular Genetics & Genomics， 2007， 278（5）： 493-505.

[9] Zhang H F， Liu W Z， Zhang Y P， et al. Identification， expression and interaction analyses of calcium-dependent protein kinase （CPK）genes in canola（Brassica napus L.）[J]. Bmc Genomics， 2014， 15（1）： 211.

[10] Zuo R， Hu R B， Chai G H， et al. Genome-wide identification， classification， and expression analysis of CDPK and its closely related gene families in poplar（Populus trichocarpa）[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 40（3）： 2 645-2 662.

[11] Tang C R， Meng Y， Fang Y J， et al. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants， 2016， 2（6）： 16 073.