牛角瓜根的抑菌活性研究

楊軍輝 何翠華 高非 王祝年

摘 要 以牛角瓜根為實驗材料，采用索氏提取法，以4種不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇）對牛角瓜的根進(jìn)行提取，并采用紙片瓊脂擴(kuò)散法對粗提物的抑菌活性進(jìn)行了評價，供試菌包括白色念珠菌等6種真菌和金黃色葡萄球菌等7種細(xì)菌。結(jié)果表明：石油醚粗提物對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希氏菌都表現(xiàn)出良好的抑菌活性，且抑菌效果接近或優(yōu)于陽性對照氟康唑，對尖孢鐮刀菌和鮑曼不動桿菌也表現(xiàn)出良好的抑菌活性；氯仿粗提物對白色念珠菌及糞鏈球菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性；乙酸乙酯粗提物對糞鏈球菌表現(xiàn)出最好的抑菌活性；甲醇粗提物的抑菌活性較弱。

關(guān)鍵詞 牛角瓜；根粗提物；紙片瓊脂擴(kuò)散法；抑菌活性；氟康唑

中圖分類號 S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Antifungal and Antimicrobial Activity of Root Extracts

from Calotropis gigantea

YANG Junhui1， HE Cuihua2， GAO Fei1 *， WANG Zhunian1

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of

Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan

571737， China

2 Technical Center of Inspection & Quarantine Bureau， Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，

Haikou， Hainan 570100， China

Abstract This research was to evaluate the antimicrobial activities of the root extracts of Calotropis gigantea. The root of C. gigantean was extracted by the Soxhlet extraction method with four different solvents， including petroleum ether， chloroform， ethyl acetate and methyl alcohol. The antimicrobial activities were evaluated against 6 tested fungi and 7 tested bacteria using disc agar diffusion method. The antimicrobial results showed that the petroleum ether root extracts exhibited excellent antimicrobial activities against Bacillus subtilis（ATCC11774）， Candida albicans（ATCC10231）， Aspergillus niger（ATCC16404）and Escherichia coil（ATCC25922）. And the antimicrobial activities were equal to or even better than the positive control fluconazole. The petroleum ether root extracts also showed good antimicrobial activities against Fusarium oxyporum（ATCC41029）and Acinetobacter baumanii （ATCC19606）； the chloroform root extracts displayed good antifungal activity against C. albicans（ATCC10231）and Streptococcus faecalis（ATCC29212）； the ethyl acetate root extracts exhibited excellent antibacterial activity against S. faecalis（ATCC29212）； the methyl alcohol root extracts showed weak antimicrobial activities.

Key words Calotropis gigantean； root extracts； disc agar diffusion； antimicrobial activities； fluconazole

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.028

牛角瓜（Calotropis gigantea），又稱羊浸樹、斷腸草、五狗臥花心等，屬蘿藦科（Asclepiadaceae）牛角瓜屬植物[1-2]，主要分布在中國海南、廣東、四川和云南等地[2]，是近年發(fā)現(xiàn)的有較高利用潛力的能源植物之一[3-4]。牛角瓜具有廣泛的藥用價值[5-7]，研究還發(fā)現(xiàn)，牛角瓜具有顯著的抗腫瘤作用[8-13]，且其中所含的一些強(qiáng)心苷和甾類物質(zhì)具有抑菌、殺蟲等作用[14-19]。有學(xué)者對牛角瓜的不同部位脂溶性提取物作了抑菌活性研究[20]，結(jié)果顯示脂溶性提取物對大腸埃希氏菌、普通變形桿菌和枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。本研究組[21]研究結(jié)果表明，牛角瓜花的脂溶性成分對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。近年來，國內(nèi)對于牛角瓜抑菌方面的研究相對較少，本文根據(jù)牛角瓜根脂溶性成分的GC-MS分析[22]，對牛角瓜根采用不同極性溶劑進(jìn)行提取，并選取多種供試菌，對得到的不同溶劑的粗提物進(jìn)行抑菌活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 牛角瓜根于2015年7月采自海南省儋州市三都鎮(zhèn)，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為蘿藦科牛角瓜屬植物牛角瓜（Calotropis gigantea （L.） Dry.ex Ait.f.）的根，存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。

1.1.2 供試菌種及培養(yǎng)基 試驗菌種及培養(yǎng)基由海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心微生物實驗室提供。

真菌：白色念珠菌Candida albicans（ATCC10231），串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme（ATCC2490），黃曲霉菌Aspergillus flavus（ATCC2003），尖孢鐮刀菌Fusarium oxyporum（ATCC41029），黑曲霉菌Aspergillus niger（ATCC16404），變紫青霉Penicillium purpurascens（ATCC40687）。

細(xì)菌：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus （ATCC25923），枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis （ATCC11774），鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumanii（ATCC19606），大腸埃希氏菌Escherichia coil（ATCC25922），糞鏈球菌Streptococcus faecalis（ATCC29212），肺炎克雷伯菌Klebsiella Pneumoniae（ATCC200603），銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa（ATCC27853）。

1.1.3 試劑 石油醚，氯仿，乙酸乙酯，甲醇，丙酮，均購于廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 牛角瓜根粗提物的制備 將采集的新鮮牛角瓜根曬干后粉碎，用密封袋密封保存?zhèn)溆?。定量稱取粉碎后的牛角瓜根粉末，用索氏提取器依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和甲醇4種溶劑進(jìn)行提取。所得提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得浸膏，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種培養(yǎng) 配置各菌種并經(jīng)傳代1次純培養(yǎng)后，用接種環(huán)挑取單個細(xì)菌菌落接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基中劃線涂布三區(qū)[23-24]，同法接種真菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h（其中尖孢鐮刀菌和變紫青霉于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)）。

1.2.3 MH（Mueller-Hinton）瓊脂培養(yǎng)基制備 稱取15.2 g基礎(chǔ)培養(yǎng)基MH瓊脂于500 mL的三角瓶中，加400 mL去離子水定容后，121 ℃高壓滅菌15 min。待基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度冷卻至45 ℃左右時在無菌條件下傾注平板，凝固后待用。

1.2.4 樣液的配置 空白組：10%的丙酮溶液。

實驗組：用10%的丙酮溶液將牛角瓜根的不同溶劑的提取浸膏配制成100 mg/mL的供試樣液。

陽性對照組：用10%的丙酮溶液將氟康唑配制成100 mg/mL的對照樣液。

1.2.5 抑菌活性測定方法 抑菌圈的測定：采用紙片瓊脂擴(kuò)散法[25-26]進(jìn)行抑菌圈測定，用無菌棉拭子涂拭少許24 h菌種培養(yǎng)物于生理鹽水并稀釋為105 CFU/mL的試驗菌液，用另一只無菌棉拭子將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板表面，待稍干后用無菌鑷子夾取經(jīng)樣液浸泡完全的圓濾紙片（直徑6.00 mm），貼于MH瓊脂平板表面。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈直徑。不同溶劑的供試樣液抑菌實驗重復(fù)3次，最后抑菌結(jié)果取3次的平均值。

最低抑制濃度（MIC）的測定：將100 mg/mL供試樣液用10%丙酮分別進(jìn)行連續(xù)二倍稀釋，得濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg/mL的樣液待測。根據(jù)抑菌實驗結(jié)果，取對供試菌抑制效果明顯的供試樣液，繼續(xù)以上述測抑菌圈的實驗方法測定最低抑制濃度（MIC）。以無抑菌圈（即濾紙片周圍供試菌生長良好）的最高濃度為該樣液的最低抑制濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛角瓜根的石油醚粗提物對供試菌的抑制作用

根的石油醚粗提物的抑菌活性見表1。從表1可看出，空白實驗組對供試菌無抑制作用，表明10%丙酮溶劑對抑菌活性無影響。在100 mg/mL濃度下，牛角瓜根的石油醚粗提物對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希氏菌、尖孢鐮刀菌、鮑曼不動桿菌表現(xiàn)出良好到優(yōu)秀的抑菌效果，其中對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出最優(yōu)的抑菌活性，且抑菌活性優(yōu)于陽性對照氟康唑，抑菌圈為13.83 mm；對白色念珠菌（抑菌圈為13.37 mm）表現(xiàn)出接近于氟康唑（抑菌圈為14.37 mm）的抑菌活性；對黑曲霉、大腸埃希氏菌、尖孢鐮刀菌、鮑曼不動桿菌也表現(xiàn)出優(yōu)于陽性對照氟康唑的抑菌活性。另外，在100 mg/mL濃度下，石油醚粗提物對糞鏈球菌、黃曲霉、金黃色葡萄球菌、變紫青霉均有抑制作用，除對黃曲霉表現(xiàn)出接近于氟康唑的抑菌效果外，對其他供試菌的抑制效果都明顯弱于氟康唑。同時，石油醚粗提物對銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和串珠鐮刀菌均沒有表現(xiàn)出抑制活性。

根不同濃度的石油醚粗提物的抑菌活性見表2。從表2可看出，隨著牛角瓜根粗提物濃度的二倍稀釋，抑菌作用也隨之減小，抑菌效果與粗提物濃度呈正相關(guān)。牛角瓜根的石油醚粗提物對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希氏菌的最低抑制濃度分別為6.25、1.56、3.125、1.56 mg/mL。

2.2 牛角瓜根的氯仿粗提物對供試菌的抑制作用

根的氯仿粗提物的抑菌活性見表3。從表3可看出，在100 mg/mL濃度下，氯仿粗提物對白色念珠菌和糞鏈球菌表現(xiàn)出相同的抑菌效果（10.59 mm）。與陽性對照氟康唑相比，氯仿粗提物對白色念珠菌的抑菌活性明顯弱于氟康唑（14.37 mm），對糞鏈球菌的抑菌活性則優(yōu)于氟康唑（10.22 mm）。氯仿粗提物對尖孢鐮刀菌、黃曲霉、鮑曼不動桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉均有一定的抑菌活性，其中對尖孢鐮刀菌和黃曲霉表現(xiàn)出優(yōu)于氟康唑的抑菌活性，對其余供試菌的抑菌活性低于氟康唑。氯仿粗提物對枯草芽孢桿菌、變紫青霉、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和串珠鐮刀菌均沒有表現(xiàn)出抑菌效果。

從表4則可以看出，牛角瓜根的氯仿粗提物對白色念珠菌和糞鏈球菌的最低抑制濃度分別為3.125 mg/mL和1.56 mg/mL。

2.3 牛角瓜根的乙酸乙酯粗提物對供試菌的抑制作用

根的乙酸乙酯粗提物的抑菌活性見表5。從表5可看出，乙酸乙酯粗提物對糞鏈球菌（抑菌圈為12.66 mm）表現(xiàn)出優(yōu)秀的抑菌效果，且抑菌效果明顯優(yōu)于氟康唑（抑菌圈為10.22 mm）。對白色念珠菌，乙酸乙酯粗提物也表現(xiàn)了良好的抑菌活性（抑菌圈為10.48 mm），但抑菌活性與氟康唑（抑菌圈為14.37 mm）存在較大的差距。對尖孢鐮刀菌，乙酸乙酯粗提物也表現(xiàn)出優(yōu)于氟康唑的抑菌活性，但對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、鮑曼不動桿菌、變紫青霉、黃曲霉、黑曲霉、金黃色葡萄球菌，乙酸乙酯粗提物的抑菌活性均低于氟康唑。對銅綠假單胞菌、串珠鐮刀菌、肺炎克雷伯菌，乙酸乙酯粗提物沒有表現(xiàn)出抑菌活性。

從表6則可以看出，牛角瓜根的乙酸乙酯粗提物對糞鏈球菌的最低抑制濃度為3.125 mg/mL。

2.4 牛角瓜根的甲醇粗提物對供試菌的抑制作用

根的甲醇粗提物的抑菌活性見表7。從表7可以看出，甲醇粗提物對黑曲霉、糞鏈球菌、黃曲霉、大腸埃希氏菌、鮑曼不動桿菌、變紫青霉都有一定的抑菌活性，除了對黑曲霉（抑菌圈為10.34 mm）表現(xiàn)出優(yōu)于氟康唑（抑菌圈為9.94 mm）的抑菌活性外，對其余供試菌的抑菌活性均比氟康唑弱。同時，甲醇粗提物對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、尖孢鐮刀菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、串珠鐮刀菌均沒有抑菌活性。

3 討論

牛角瓜資源豐富，具有廣泛的藥用價值，用于治療各種疾病，在抗菌和抗腫瘤方面引起了廣泛關(guān)注。Ishnava等[18]對白花牛角瓜乳汁進(jìn)行了體外抑菌活性研究，結(jié)果表明氯仿提取物對嗜酸乳酸桿菌和變異鏈球菌有明顯的抑菌效果，甲醇提取物對緩癥鏈球菌具較好的抑菌活性。Sehgal等[27]報道了白花牛角瓜在體外殺蟲、驅(qū)蟲等的作用。Kareem等[28]報道了白花牛角瓜對致病性細(xì)菌和真菌的抗菌活性。Parhira[11]等從牛角瓜乳汁中分離出的2種強(qiáng)心苷，對低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）具有一定的抑制作用。

本研究采用索氏提取法，以牛角瓜根為材料，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇4種溶劑依次提取，對粗提物進(jìn)行了更廣泛的供試菌的抑菌活性研究。結(jié)果表明，4種不同溶劑粗提物的抑菌效果存在很大差異，對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希氏菌，石油醚粗提物均表現(xiàn)出優(yōu)秀的抑菌活性，且抑菌效果接近或優(yōu)于陽性對照氟康唑，對尖孢鐮刀菌和鮑曼不動桿菌也表現(xiàn)出良好的抑菌活性；氯仿粗提物對白色念珠菌及糞鏈球菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性；乙酸乙酯粗提物對糞鏈球菌表現(xiàn)出最好的抑菌活性；甲醇粗提物的抑菌效果較弱，且對多種菌沒有活性。4種溶劑粗提物對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希氏菌、尖孢鐮刀菌和鮑曼不動桿菌的抑制能力均為：石油醚粗提物優(yōu)于乙酸乙酯、氯仿和甲醇粗提物；對糞鏈球菌的抑制能力為：乙酸乙酯粗提物最優(yōu)。可見，除糞鏈球菌外，石油醚粗提物表現(xiàn)出最廣譜及最優(yōu)的抑菌活性。由結(jié)果分析，造成不同溶劑粗提物抑菌活性差異的原因可能有：①溶劑使用的先后順序。由于石油醚最先使用，因此大部分活性物質(zhì)優(yōu)先溶解于石油醚中，其次是氯仿與乙酸乙酯，最后是甲醇，這就使得石油醚粗提物具有最優(yōu)的抑菌效果；②溶劑的極性。乙酸乙酯粗提物對糞鏈球菌表現(xiàn)出最好的抑菌效果，但乙酸乙酯在第三位被使用，根據(jù)“相似相溶”原理推測，對糞鏈球菌高效的抑菌活性物質(zhì)在極性相對較低的溶劑中溶解較少，在和它極性相似的乙酸乙酯中溶解較多，推測溶劑的極性對抑菌物質(zhì)的提取有較大的影響；③抑菌活性物質(zhì)的種類。不同溶劑粗提物的抑菌效果存在很大差異，推測各種粗提物的組分各不相同。由于不同的溶劑粗提物是混合組分，在抑菌過程中可能存在協(xié)同、拮抗等機(jī)制，為今后的單體抑菌活性研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國科學(xué)院華南植物研究所. 海南植物志（第3卷）[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1974： 255.

[2] 中國科學(xué)院植物志編輯委員會. 中國植物志（第63卷）[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1977： 384-386.

[3] 傅登祺， 黃宏文， 武 漢. 能源植物資源及其開發(fā)利用簡況[J]. 植物科學(xué)學(xué)報， 2006， 24（2）： 183-190.

[4] 李 瑞， 曾建立， 王曉東， 等. 耐鹽堿植物牛角瓜產(chǎn)能成分分析[J]. 過程工程學(xué)報， 2007， 7（6）： 1 217-1 220.

[5] 杜海燕. 白花牛角瓜根氯仿提取物抗胃潰瘍作用的實驗研究[J]. 國際中醫(yī)中藥雜志， 1998（3）： 40.

[6] 張士俊. 白花牛角瓜根提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 1991（6）： 270-271.

[7] 李琬聰， 晏永明， 鐘惠民. 白花牛角瓜根部的化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2012， 24（10）： 1 390-1 392.

[8] Mijatovic T， Van Q E， Delest B， et al. Cardiotonic steroids on the road to anti-cancer therapy[J]. Biochimica Et Biophysica Acta， 2007， 1776（1）： 32-57.

[9] Mijatovic T， Kiss R. Cardiotonic Steroids-Mediated Na+/K+-ATPase Targeting Could Circumvent Various Chemoresistance Pathways[J]. Planta Medica， 2013， 79（3-4）： 189-198.

[10] You H， Lei M， Song W， et al. Cytotoxic cardenolides from the root bark of Calotropis gigantea[J]. Steroids， 2013， 10（10）： 1 029-1 034.

[11] Parhira S， Zhu G Y， Jiang R W， et al. 2'-Epi-uscharin from the latex of Calotropis gigantea with HIF-1 inhibitory activity[J]. Scientific Reports， 2014， 4： 4 748-4 748.

[12] Calderón-Montano J M， Burgos-Morón E， Orta M L， et al. Evaluating the cancer therapeutic potential of cardiac glycosides[J]. Biomed Research International， 2014， 1： 85-117.

[13] Ibrahim S R M， Mohamed G A， Shaala L A， et al. Calotroposides H-N， new cytotoxic oxypregnane oligoglycosides from the root bark of Calotropis procera[J]. Steroids， 2015， 96： 63-72.

[14] Larhsini M， Oumoulid L， Lazrek H B， et al. Antibacterial activity of some Moroccan medicinal plants[J]. Phytotherapy Research， 2001， 15（3）： 250-252.

[15] Ali N A A， Jülich W D， Kusnick C， et al. Screening of Yemeni medicinal plants for antibacterial and cytotoxic activities[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2001， 74（2）： 173-179.

[16] Ahmed U A M， Shi Z， Bashier N H H， et al. Evaluation of Insecticidal Potentialities of Aqueous Extracts from Calotropis procera Ait. Against Henosepilachna elaterii Rossi[J]. Journal of Applied Sciences， 2006， 6（11）： 2 466-2 470.

[17] Lima-Filho J V， Patriota J M， Silva A F B， et al. Proteins from latex of Calotropis procera prevent septic shock due to lethal infection by Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2010， 129（3）： 327-334.

[18] Ishnava K B， Chauhan J B， Garg A A， et al. Antibacterial and phytochemical studies on Calotropis gigantia （L.） R. Br. latex against selected cariogenic bacteria[J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 2012， 19（1）： 87-91.

[19] Rajkuberan C， Sudha K， Sathishkumar G， et al. Antibacterial and cytotoxic potential of silver nanoparticles synthesized using latex of Calotropis gigantea L[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy， 2015， 136： 924-930.

[20] 鄧 佳， 王 芳， 史正軍， 等. 野生牛角瓜不同部位脂溶性提取物抑菌活的性研究[J]. 北方園藝， 2014（24）： 144-146.

[21] 王茂媛， 王建榮， 張新蕊， 等. 牛角瓜花脂溶性成分及其抗菌活性研究[J]. 中藥材， 2013， 36（3）： 404-407.

[22] 王茂媛， 戴好富， 王祝年. 牛角瓜根脂溶性成分的GC-MS分析[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2010， 31（11）： 2 039-2 042.

[23] 田樹革， 劉 慶. 新疆芍藥色譜圖譜分析及芍藥苷的含量測定[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志， 2003（4）： 32-33.

[24] 李明遠(yuǎn). 微生物學(xué)與免疫學(xué)[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2002： 84-126.

[25] Bauer A W， Perry D M， Kirby W M. Single-disk antibiotic-sensitivity testing of staphylococci： an analysis of technique and results[J]. A M A archives of Internal Medicine， 1959， 104（104）： 208-216.

[26] Bauer A W， Kirby W M， Sherris J C， et al. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method[J]. American Journal of Clinical Pathology， 1966， 45（3）： 493-496.

[27] Sehgal R， Arya S， Kumar V L， et al. Inhibitory effect of extracts of latex of Calotropis procera against Candida albicans： A preliminary study[J]. Indian Journal of Pharmacology， 2005， 37（5）： 334-335.

[28] Parekh J， Chanda S V. In vitro Antimicrobial activity and phytochemical analysis of some Indian medicinal plants[J]. Turkish Journal of Biology， 2007， 31（1）： 53-58.