對照品法和對照提取物法測定崗松油中α—蒎烯、β—蒎烯、桉油精和芳樟醇含量比較分析

羅軼　白桂昌　陸敏儀

摘要：目的 分別用對照品法和對照提取物法測定崗松油中α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量，探討選擇對照提取物替代單體對照品測定崗松油含量的可行性。方法 采用DB-5氣相毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 ?m）；程序升溫：起始溫度80 ℃，保持15 min，1 ℃/min升至90 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至110 ℃，25 ℃/min升至240 ℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃。結(jié)果 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇在各自的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系（r≥0.999），平均回收率為96.5%～102.2%；t檢驗表明2種測定方法得出的含量結(jié)果無明顯差異。結(jié)論 對照提取物法可用于崗松油的質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞：對照品法；對照提取物法；氣相色譜法；崗松油；α-蒎烯；β-蒎烯；桉油精；芳樟醇；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.023

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）10-0100-04

Abstract： Objective To determinate the contents of α-pinene， β-pinene， eucalyptol and linalool in Baeckea frutescens by reference substances method and reference extract method respectively； To explore the feasibility of replacing single component reference by control extracts in assay. Methods The GC system consisted of a quartz column DB-5 （60 m×0.25 mm×0.25 ?m）； The temperature programming rose from 80 ℃ （15 min） to 90 ℃ by 1 ℃/min， lasting 2 min， then 10 ℃/min to 110 ℃， then 25 ℃/min to 240 ℃， lasting 8 min in the end； The temperature of the entrance of capillary vessel column was 250 ℃， and the temperature of the detector was 250 ℃. Results α-pinene， β-pinene， eucalyptol and linalool were in a good linear relationship within each concentration scope （r≥0.999）. The average recovery rates were in the range of 96.5%–102.2%. The results of t-test demonstrated that there is no significant difference between the two methods. Conclusion The reference extract method can be used as a quality evaluation pattern for Baeckea frutescens.

Key words： reference substances method； reference extract method； gas phase chromatography； Baeckea frutescens； α-pinene； β-pinene； eucalyptol； linalool； content determination

多成分含量測定法逐漸成為中藥質(zhì)量控制的趨勢。由于中藥成分復(fù)雜，從藥材中提取、分離、制備對照品對分離及制備技術(shù)要求很高，從而導(dǎo)致對照品供應(yīng)困難，也不利于檢驗成本控制，且部分對照品的穩(wěn)定性差，難以解決儲存和運(yùn)輸?shù)葐栴}。為減少單體中藥化學(xué)對照品的使用，“一測多評”的含量測定方法在一定程度上解決了中藥對照品短缺的問題，現(xiàn)已在多種中藥的多成分定量分析和多指標(biāo)質(zhì)量控制中得到應(yīng)用[1-3]，但此方法的實用性和耐用性存在一些問題[4]。開發(fā)標(biāo)定多個單體成分含量的對照提取物是解決中藥化學(xué)對照品短缺問題的一個好方法[5-6]。

崗松油為桃金娘科植物崗松Baeckea frotescens L.的枝葉經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于廣西壯族自治區(qū)《壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第一卷，在醫(yī)藥及香精香料等領(lǐng)域具有較廣泛的應(yīng)用。目前該品種的地方標(biāo)準(zhǔn)含量測定項只有桉油精和芳樟醇2個檢測指標(biāo)[7]，難以控制本品的內(nèi)在質(zhì)量。本研究建立對照提取物法測定崗松油中α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量測定方法，并與傳統(tǒng)的外標(biāo)對照品法進(jìn)行比較，以進(jìn)一步完善崗松油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

美國安捷倫公司Agilent 6890N型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器（FID）；瑞士METTLER TOLEDO XS205電子天平。α-蒎烯對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，批號110897-200502），β-蒎烯對照品（Chem Service，批號207500，含量99.5%），桉油精對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，批號110788-201105），芳樟醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，含量98.5%，批號11503-201302）；崗松油對照提取物（自標(biāo)，α-蒎烯9.17%，β-蒎烯9.38%，桉油精8.13%，芳樟醇8.13%）；崗松藥材經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所黃清泉藥師鑒定，為桃金娘科植物崗松Baeckea frotescens L.帶有花果的枝葉；28批崗松油樣品由廣西源安堂藥業(yè)有限公司提供；無水乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-5氣相毛細(xì)管色譜柱（柱長60 m，內(nèi)徑 0.25 mm，膜厚0.25 ?m）；流速：1.0 mL/min；柱溫為程序升溫：初始溫度80 ℃，保持15 min，以1 ℃/min速率升溫至90 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min速率升溫至110 ℃，25 ℃/min升溫至240 ℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；進(jìn)樣量1 ?L。色譜圖見圖1。

2.2 對照提取物的制備

取凈選后的崗松枝葉藥材，加水10倍量，水蒸氣蒸餾2 h，靜置，分取油層，封裝于安瓿瓶中，即得崗松油對照提取物。

2.3 對照溶液制備

2.3.1 對照品溶液制備 分別精密取α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇對照品適量，精密稱定，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含α-蒎烯對照品0.3 mg、β-蒎烯對照品0.3 mg、桉油精對照品0.4 mg、芳樟醇對照品0.4 mg的混合溶液，即得。

2.3.2 對照提取物溶液制備 精密稱取崗松油對照提取物0.2 g，置50 mL量瓶中，加無水乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液制備

精密稱取本品0.2 g，置50 mL量瓶中，加無水乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1 單一對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取α-蒎烯對照品261.12 mg，置10 mL量瓶中，加無水乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻：精密稱取β-蒎烯對照品270.15 mg，置10 mL量瓶中，加無水乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密稱取桉油精對照品230.21 mg，置10 mL量瓶中，加無水乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密稱取芳樟醇對照品267.08 mg，置10 mL量瓶中，加無水乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取上述α-蒎烯對照品溶液、β-蒎烯對照品溶液、桉油精對照品溶液及芳樟醇對照品溶液各2 mL，置同一10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液①。精密吸取混合對照品溶液①2.0 mL，分別置5、10、20 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液②、③、④；精密吸取混合對照品溶液④2.0 mL，分別置5、20、50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液⑤、⑥、⑦。分別精密吸取混合對照品溶液①～⑦，進(jìn)樣1 μL，測定。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：α-蒎烯Y=1.725 6×103X+11.151，r=1.000 0；β-蒎烯Y=1.827 2×103X+12.326×10，r=1.000 0；桉油精Y=1.556 9×103X+81.778，r=1.000 0；芳樟醇Y=1.532 8×103X+13.401，r=0.999 9。

2.5.2 對照提取物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取崗松油對照提取物10.40、55.35、196.28、507.28、1009.16、2016.10 mg，分別置50 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，作為對照提取物系列溶液。分別精密吸取上述對照提取物溶液，進(jìn)樣1 μL，測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：α-蒎烯Y=1.690 1×106X-6.967 0×104，r=0.999 8；β-蒎烯Y=1.795 1×106X-7.223 7×104，r=0.999 8；桉油精Y=1.593 8×106X-6.458 7×104，r=0.999 6；芳樟醇Y=1.597 0×106X-4.646 6×104，r=0.999 8。

2.6 精密度試驗

取同一份供試品溶液（批號20131129），連續(xù)測定6次，記錄α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.57%、0.60%、0.67%、0.69%，表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液（批號20131129），分別于0、5、10、16、24、36 h進(jìn)樣，測定α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.97%、0.77%、0.79%、0.72%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（20131129）9份（0.1、0.2、0.4 g各3份），按“2.4”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果α-蒎烯含量為8.243 2%，RSD=2.51%；β-蒎烯含量為7.585 0%，RSD=2.96%；桉油精含量為10.252 6%，RSD=1.30%；芳樟醇含量為7.438 4%，RSD=1.66%。

2.9 加樣回收率試驗

2.9.1 對照品加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號20130711，α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇含量分別為9.299 8%、9.345 9%、8.322 6%、8.252 4%）0.1 g，共9份，分別精密加入α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇對照品溶液適量，按“2.4”項下方法操作，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果α-蒎烯平均加樣回收率為102.22%，RSD=1.98%（n=9）；β-蒎烯平均加樣回收率為101.07%，RSD=1.25%（n=9）；桉油精平均加樣回收率為101.34%，RSD=2.15%（n=9）；芳樟醇平均加樣回收率為101.10%，RSD=2.18%（n=9）。

2.9.2 對照提取物加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號20131129，α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量分別為8.243 2%、7.585 0%、10.252 6%、7.438 4%）0.1 g，共9份，分別精密加入崗松油對照提取物（批號20130711）50、100、200 mg（各3份），按“2.4”項下方法操作，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果α-蒎烯平均加樣回收率為97.65%，RSD=2.19%（n=9）；β-蒎烯平均加樣回收率為97.20%，RSD=1.66%（n=9）；桉油精平均加樣回收率為96.54%，RSD=1.26%（n=9）；芳樟醇平均加樣回收率為98.09%，RSD=1.11%（n=9）。

2.10 對照品法和對照提取物法測定結(jié)果比較

取樣品（批號20131129），按3個梯度0.1、0.2、0.4 g取樣，每梯度取樣5份，采用對照品法及對照提取物法同時進(jìn)行測定，經(jīng)t檢驗，除芳樟醇外，α-蒎烯和β-蒎烯總量（α-蒎烯和β-蒎烯為同分異構(gòu)體，可合并計算）、桉油精測定的結(jié)果均存在明顯差異，但2種方法測定結(jié)果RSD值均小于1.0%，表明差異較小，認(rèn)為采用對照提取物法代替對照品法測定是可行的。

2.11 樣品測定

取不同批號樣品，按“2.4”項下方法制成供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精和芳樟醇的含量含量，結(jié)果見表2。對測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，結(jié)果α-蒎烯和β-蒎烯總量、桉油精、芳樟醇測定結(jié)果未見明顯差異，且2種方法測定結(jié)果RSD值均小于4.0%，差異較小，可以采用對照提取物替代對照品進(jìn)行崗松油的質(zhì)量控制。

3 討論

本試驗曾用DB-5、WonderCap-5、SPB-5色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果不同品牌色譜柱的耐用性都很好；曾用Agilent6890A、島津2010-plus氣相色譜儀進(jìn)行分離，結(jié)果不同品牌的氣相色譜儀耐用性都很好。供試品曾分別用無水乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷溶解后進(jìn)樣測定，結(jié)果得到的色譜圖基本一致，使用低毒的無水乙醇直接稀釋樣品，方法簡單可行。

采用已標(biāo)定各成分含量的對照提取物代替多個化學(xué)對照品進(jìn)行定量，具有簡便、運(yùn)行成本低的優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊。

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（收稿日期：2016-04-01）

（修回日期：2016-05-16；編輯：陳靜）