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    Rv0652蛋白對膀胱癌細胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響

    2016-10-24 05:34:04楊江華楊國良潘麒薄雋杰
    山東醫(yī)藥 2016年31期
    關鍵詞:蛋白組卡介苗增殖率

    楊江華,楊國良,潘麒,薄雋杰

    (上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院,上海200217)

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    Rv0652蛋白對膀胱癌細胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響

    楊江華,楊國良,潘麒,薄雋杰

    (上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院,上海200217)

    目的觀察結核桿菌屬PE_PGRS蛋白家族成員Rv0652對膀胱癌細胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響。方法 在96孔板中接種膀胱癌T24、J82、RT4細胞懸液,每孔100 μL,含相應膀胱癌細胞5 000個。設空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組,分別加入DMEM培養(yǎng)液100 μL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液,12、24、36、48 h采用CCK-8試劑盒測定OD值,計算細胞增殖率。另取膀胱癌T24、J82、RT4細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,設空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組,分別加入DMEM培養(yǎng)液10 mL、含體外重組Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后采用PI和FITC- Annexin V雙染色,流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。結果 隨著培養(yǎng)時間延長,Rv0652蛋白組、卡介苗組膀胱癌細胞RT4、J82、T24增殖率逐漸下降(P均<0.05);相同培養(yǎng)時間Rv0652蛋白組、卡介苗組細胞增殖率相比,P均>0.05。Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細胞凋亡率均高于對照組(P均<0.05);Rv0652蛋白組、卡介苗組相比,P均>0.05。結論 Rv0652蛋白能抑制膀胱癌細胞T24、J82、RT4增殖,誘導細胞凋亡,效果與卡介苗類似。

    膀胱癌;膀胱癌細胞;Rv0652蛋白;卡介苗;細胞增殖;細胞凋亡

    膀胱內(nèi)灌注化療藥物(如吉西他濱、吡柔比星、絲裂霉素等)或免疫治療藥物(如卡介苗)有助于降低經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(TURBT)后非肌層浸潤性膀胱癌的復發(fā)率[1,2],但仍有30%的患者術后經(jīng)卡介苗膀胱灌注治療無效,70%接受卡介苗膀胱灌注治療的患者會發(fā)生不良反應[3,4]。Rv0652蛋白是從結核分枝桿菌中分離出的蛋白,是結核桿菌PE_PGRS蛋白家族成員[5]。Rv0652蛋白在活動性結核患者體內(nèi)能誘導很強的抗體反應,同時可激活巨噬細胞,誘導TNF及MCP-1生成[6]。Rv0652還能通過結合Toll樣受體4(TLR4)誘導樹突狀細胞分化成熟,產(chǎn)生TNF、IL-6等炎癥因子,激活MyD88和TRIF信號通路[7,8]。這些信號通路及細胞因子均與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關。故我們推測Rv0652有可能產(chǎn)生與卡介苗類似的抗膀胱腫瘤效應。2015年9月~2016年3月,我們觀察了Rv0652蛋白對膀胱癌細胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響,并與卡介苗進行比較,現(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1實驗細胞與材料膀胱癌細胞系T24、J82、RT4購自上海國標生物科技有限公司。CCK8試劑盒購自日本同仁公司;PI-AnnexinV購自美國BD公司;DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶購自Gibco公司,青霉素、鏈霉素購自Hyclone公司;ELISA試劑盒購自美國BD公司。膀胱灌注用卡介苗購自日本伯川公司。Rv0652蛋白采用文獻[4]方法獲取。

    1.2Rv0652蛋白、卡介苗對膀胱癌細胞增殖的影響觀察采用CCK8法。在96孔板中接種膀胱癌T24、J82、RT4細胞懸液,每孔100 μL,含相應膀胱癌細胞5 000個。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預培養(yǎng);細胞貼壁后,更換培養(yǎng)液。設空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組,分別加入DMEM培養(yǎng)液100 μL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液,分別于12、24、36、48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h,用酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度值(OD值)。每個檢測點設3個復孔。計算Rv0652蛋白組和卡介苗組細胞增殖率。細胞增殖率=(處理組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

    1.3Rv0652蛋白、卡介苗對膀胱癌細胞凋亡的影響觀察采用PI-AnnexinV法。膀胱癌T24、J82、RT4細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中。設空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組,分別加入DMEM培養(yǎng)液10 mL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PI和FITC- Annexin V雙染色,然后用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況,計算細胞凋亡率。

    2 結果

    2.1Rv0652蛋白組、卡介苗組細胞增殖率比較隨著培養(yǎng)時間延長,Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細胞增殖率逐漸下降(P均<0.05);相同培養(yǎng)時間Rv0652蛋白組、卡介苗組細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義。詳見表1。

    表1 不同培養(yǎng)時間Rv0652蛋白組、卡介苗組的膀胱癌RT4、J82、T24細胞增殖率比較

    注:與同組同類細胞培養(yǎng)12 h相比,*P<0.05;與同組同類細胞培養(yǎng)24 h相比,#P<0.05;與同組同類細胞培養(yǎng)36 h相比,△P<0.05。

    2.2各組細胞凋亡率比較Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細胞凋亡率均高于對照組(P均<0.05);Rv0652蛋白組、卡介苗組相比,P均>0.05。詳見表2。

    表2 各組細胞凋亡率比較

    注:與對照組同類細胞相比,*P<0.05。

    3 討論

    在我國,膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,其主要診斷和治療手段是TURBT術,但膀胱腫瘤術后復發(fā)率超過50%,一部分患者會進展至肌層浸潤性膀胱癌[7]。為了減少膀胱癌的術后復發(fā),臨床推薦患者術后進行膀胱灌注治療[8]。其中卡介苗是高危非肌層浸潤性膀胱癌治療的首選藥物[9]。已有研究[10]表明,卡介苗可抑制膀胱癌細胞增殖,同時促進膀胱腫瘤細胞凋亡,然而卡介苗是減毒活菌制劑,不良反應較多[11,12]??ń槊缰委煹娜聿涣挤磻邪l(fā)熱、全身不適、結核菌敗血癥、肺部結核感染、肝臟毒性、全身皮疹等[13,14];局部不良反應有化學性膀胱炎、尿頻、膀胱攣縮、肉芽腫性前列腺炎等[15,16]。上述不良反應限制了卡介苗在膀胱癌治療中的臨床應用。

    Rv0652蛋白是從結核分枝桿菌中分離出的蛋白,是結核桿菌PE_PGRS蛋白家族成員之一。結核桿菌PE蛋白家族這是一組富含甘氨酸和丙氨酸的酸性蛋白家族,它們的氨基末端附近都含有脯氨酸-谷氨酸基序。該家族蛋白質(zhì)編碼基因包含稱為PGRS的多拷貝串聯(lián)重復序列,在基因組中成簇散在分布。PE家族的PGRS片段與EB病毒的EB病毒核抗原1(EBNA-1)序列具有明顯同源性。已有研究[4]表明Rv0652可通過TLR4和MyD88激活巨噬細胞,誘導巨噬細胞成熟,促進巨噬細胞分泌炎癥因子,其中包括TNF和MCP-1。此外,Rv0652被TLR4識別后可誘導樹突狀細胞成熟分化,促進TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放[6]。Rv0652還可能激活Fas/FasL途徑引起細胞凋亡。我們推測Rv0652可抑制膀胱癌細胞增殖和凋亡。本研究結果顯示,隨著培養(yǎng)時間延長,Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細胞增殖率逐漸下降;Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細胞凋亡率均高于對照組。本研究結果印證了上述猜測。

    Rv0652蛋白抑制膀胱癌細胞增殖、誘導膀胱癌細胞凋亡可能涉及多種機制。一方面,Rv0652作為單體蛋白質(zhì)可直接結合細胞膜,影響膜流動性,從而影響細胞活力。同時Rv0652與膀胱癌細胞系T24、J82、RT4結合后,激活Fas/FasL通路,引起Caspase-8的活化,從而引起膀胱癌細胞凋亡。此外,Rv0652可通過結合TLR4誘導大量炎癥因子釋放,包括TNF-α等,可能激活依賴TNF-α的凋亡信號通路來誘導細胞凋亡。Rv0652抑制膀胱癌細胞系增殖、促進膀胱癌細胞凋亡的效果與卡介苗類似,而且Rv0652作為單體蛋白質(zhì),不具有卡介苗完整的菌體,可以減小卡介苗引起的全身感染的發(fā)生風險,避免了卡介苗的不良反應,值得參考應用。

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    國家自然科學基金資助項目(81372188)。

    薄雋杰(E-mail: renjibojj@163.com)

    10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.011

    R737.14

    A

    1002-266X(2016)31-0037-03

    2016-04-15)

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