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    基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析篩選五龍鵝產(chǎn)蛋相關(guān)候選基因

    2025-01-27 00:00:00魯秀張名愛孔敏張晶王秉翰侯中一滕興怡姜雅靜凡文磊王寶維
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2025年1期

    摘 要: 旨在通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析來挖掘五龍鵝產(chǎn)蛋量相關(guān)候選基因,為其產(chǎn)蛋性能遺傳機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。本研究選取200只體重相近的36周齡健康五龍鵝種鵝,記錄其36~54周齡產(chǎn)蛋情況。在產(chǎn)蛋后期(54周齡)時,根據(jù)產(chǎn)蛋水平,將產(chǎn)蛋量最高的30只鵝定為高產(chǎn)組,產(chǎn)蛋量最低的30只鵝定為低產(chǎn)組,從高產(chǎn)組(H)和低產(chǎn)組(L)鵝中各采集3個卵巢組織,提取RNA和蛋白質(zhì),通過轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)和4D-DIA蛋白組定量分析篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)和差異表達(dá)蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)。之后對篩選的差異基因和蛋白進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證、功能富集分析和蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析,篩選鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān)的候選基因。結(jié)果:共鑒定到450個DEGs和333個DEPs,其中,AFAP1、INHA、FNDC1、INHBB在基因和蛋白水平上表達(dá)出相同的差異趨勢。富集分析顯示,DEGs和DEPs顯著富集到364個GO條目和75個KEGG通路,涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育(gland development)、性別分化(sex differentiation)、性激素活性(hormone activity)、TGF-β通路(TGF-β signaling pathway)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、GnRH信號通路(GnRH signaling pathway)、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)等多個與產(chǎn)蛋相關(guān)的通路和關(guān)鍵生物過程。選取9個潛在候選基因,對高產(chǎn)組和低產(chǎn)組(包含轉(zhuǎn)錄組測序樣品)各8個卵巢組織進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致。基于上述研究結(jié)果,本研究最終篩選到6個與五龍鵝產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)的候選基因(PTTG1、LRP2、TNFSF10、INHA、INHBB、FST),豐富了五龍鵝產(chǎn)蛋性能的相關(guān)分子機(jī)制。

    關(guān)鍵詞: 五龍鵝;轉(zhuǎn)錄組;蛋白組;產(chǎn)蛋量;候選基因

    中圖分類號:S835.3""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A""""" 文章編號: 0366-6964(2025)01-0232-14

    收稿日期:2024-07-22

    基金項(xiàng)目:國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2023YFD1300300);國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-43-11);山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2021CXGC010805);農(nóng)業(yè)農(nóng)村部政府購買服務(wù):鵝高繁性狀精準(zhǔn)評價和分子鑒定(19230551)

    作者簡介:魯 秀(1997-),女,山東新泰人,碩士生,主要從事動物遺傳與育種研究,E-mail: luxiu911@163.com

    *通信作者:凡文磊,主要從事動物遺傳與育種方向的研究,E-mail: fanwenlei@qau.edu.cn;王寶維,主要從事動物營養(yǎng)與保健方向的研究,E-mail: wangbw1959@qq.com

    Screening for Candidate Genes Related to Egg Production in Wulong Geese Based on Transcriptome

    and Proteome Analyses

    LU" Xiu ZHANG" Ming’ai 2022年商品鵝出欄量達(dá)到4.68億只,肉鵝產(chǎn)值高達(dá)526.73億元[1。然而,在鵝產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時,正在面臨著繁殖性能差的卡脖子問題2。因此,深入挖掘影響鵝產(chǎn)蛋量的關(guān)鍵基因,對鵝產(chǎn)蛋性狀分子標(biāo)記輔助育種與鵝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

    家禽產(chǎn)蛋量受卵巢和卵泡發(fā)育水平的影響,而生長因子、激素以及卵泡閉鎖等多個因素均能通過調(diào)控卵泡發(fā)育水平影響家禽的繁殖性能。利用基因組學(xué)技術(shù)對揚(yáng)州鵝、四川白鵝的基因進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)了大量與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNPs位點(diǎn),以及GnRH和GnIH等基因3,證實(shí)這些基因在性腺軸中起關(guān)鍵作用,揭示了與產(chǎn)蛋量之間的關(guān)聯(lián)性。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對山麻鴨4、浙東白鵝5等產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行研究,篩選出了INHA、GDF9、FST[6、BMP、EGR[7等基因,這些基因在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中發(fā)揮重要作用,對于維持繁殖功能的穩(wěn)定具有重要意義。黃宣等8采用蛋白組學(xué)技術(shù)對高低產(chǎn)雞卵巢進(jìn)行深度分析后發(fā)現(xiàn),CYP11A1、HSD3B1等蛋白可能與類固醇激素合成過程有關(guān),對卵泡的發(fā)育和排卵過程具有重要作用。盡管,目前對家禽產(chǎn)蛋調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了一定程度的了解,但仍存在很多問題有待闡明,如具體影響產(chǎn)蛋量的基因和通路,高產(chǎn)和低產(chǎn)鵝在卵巢表達(dá)上有何差異等。

    豁眼鵝(五龍鵝)是我國產(chǎn)蛋性能最優(yōu)秀的地方鵝品種之一,年產(chǎn)蛋量可達(dá)100枚左右。但是在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn),同一群體中的不同個體,在產(chǎn)蛋水平上存在較大差異,群體內(nèi)變異較大[9。因此,本研究通過在同一五龍鵝群體中篩選高產(chǎn)和低產(chǎn)個體,對其卵巢組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析,旨在篩選影響五龍鵝產(chǎn)蛋量的關(guān)鍵候選基因,為后續(xù)利用分子標(biāo)記輔助育種培育鵝高繁配套系奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動物及樣本采集

    選擇200只36周齡體重相近、健康的五龍鵝母鵝為研究對象,試驗(yàn)群體飼養(yǎng)于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所育種基地,飼養(yǎng)模式為單籠飼養(yǎng)。在36~54周齡期間記錄全部產(chǎn)蛋量,根據(jù)產(chǎn)蛋水平分為高產(chǎn)組和低產(chǎn)組,其中產(chǎn)蛋量最高的30只鵝定為高產(chǎn)組,產(chǎn)蛋量最低的30只鵝定為低產(chǎn)組。在產(chǎn)蛋后期(54周齡)屠宰,屠宰前12 h內(nèi)禁食、自由飲水。屠宰后,采集卵巢組織(去除等級卵泡),用RNase-free水沖洗干凈,吸干表面水分,迅速放入液氮速凍,置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)選取3個卵巢組織,即3個高產(chǎn)組(H)樣品和3個低產(chǎn)組(L)樣品,送至武漢邁特維爾生物科技有限公司,將卵巢樣勻漿后取部分樣品進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)提取,用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序與蛋白質(zhì)測序。

    1.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理

    采用Trizol法提取總RNA,利用Qsep400生物分析儀精確檢測RNA完整性,質(zhì)檢合格后,用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,隨后用fragmentation buffer將RNA打斷成短片段,以此為模板,用六堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,并以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。最后用PCR法富集cDNA,構(gòu)建鵝卵巢cDNA文庫。構(gòu)建完成后,使用高通量核酸蛋白分析系統(tǒng)對文庫的insert size進(jìn)行檢測,完成文庫質(zhì)檢。采用Illumina平臺測序,使用fastp 0.23.2對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;利用Hisat2 2.2.1將樣本clean reads與鵝參考基因組進(jìn)行序列比對。建庫及測序過程均由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

    1.3 蛋白組測序數(shù)據(jù)處理

    取勻漿后的樣品,加入含有1 mmol·L-1 PMSF(苯甲基磺酰氟)和2 mmol·L-1 EDTA(乙二胺四乙酸)以及8 mol·L-1尿素的混合裂解緩沖液中孵育5 min,充分裂解,離心取上清。通過BCA法測定總蛋白濃度后,根據(jù)濃度取等量蛋白溶液,用8 mol·L-1尿素將體積補(bǔ)全至200 μL,經(jīng)10 mmol·L-1 DTT(二硫蘇糖醇)還原、50 mmol·L-1 IAM(碘乙酰胺)烷基化處理后,用預(yù)冷丙酮沉淀蛋白。離心后,將蛋白沉淀風(fēng)干并重懸于碳酸氫銨溶液和胰蛋白酶(Promega)中,37℃消化過夜。消化產(chǎn)物經(jīng)C 18柱料脫鹽,真空離心濃縮,并溶解于1 mL·L-1甲酸中。此后,使用NanoElute高效液相色譜儀和timsTOF Pro2質(zhì)譜儀進(jìn)行分析;使用DIA-NN軟件以Library free方法搜庫,進(jìn)行質(zhì)譜解析,完成蛋白定量。

    1.4 DEGs、DEPs篩選及功能富集分析

    使用String Tie進(jìn)行新基因預(yù)測,使用Feature Counts計(jì)算基因在樣本中的表達(dá)量。使用DESeq2對基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異分析,差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05且log 2FC≥1.0。利用t檢驗(yàn)對兩組樣本間蛋白表達(dá)量進(jìn)行組間差異顯著性的檢驗(yàn),差異表達(dá)蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05且FC≥1.2或FC≤0.83。合并DEGs和DEPs,并通過在線網(wǎng)站DAVID進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號通路分析。

    1.5 熒光定量PCR驗(yàn)證

    在篩選出的與產(chǎn)蛋相關(guān)候選基因中隨機(jī)選擇出9個DEGs(LRP2、TNFSF10、A2M、SNRPA1、PTTG1、BMP5、FST、PRLHR、INHBB),以GAPDH作為內(nèi)參基因,并且在高產(chǎn)組和低產(chǎn)組的卵巢組織中進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。利用NCBI Primer-BLAST (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線工具設(shè)計(jì)引物,引物由青島蔚來生物科技有限公司合成。熒光定量PCR試劑盒采購自湖南艾科瑞生物工程有限公司,熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:上、下游引物(表1)各0.4 μL,cDNA模板2 μL,酶Mix 10 μL,ddH 2O 7.2 μL;反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火延伸30 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對mRNA表達(dá)量,并通過t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.6 DEGs、DEPs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

    利用在線數(shù)據(jù)庫STRING對與產(chǎn)蛋相關(guān)的候選基因和候選蛋白進(jìn)行檢索,并結(jié)合Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),利用Cyto Hubba插件統(tǒng)計(jì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(degree)和節(jié)點(diǎn)的中介中心性(between centrality),探究互作網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特征,并進(jìn)行可視化與分析,進(jìn)一步篩選產(chǎn)蛋相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。

    2 結(jié) 果

    2.1 高、低產(chǎn)鵝產(chǎn)蛋情況

    在36~54周齡的產(chǎn)蛋周期內(nèi),將200只鵝根據(jù)產(chǎn)蛋量進(jìn)行排序,排名前30的鵝劃分為高產(chǎn)組,排名后30的鵝劃分為低產(chǎn)組,其中高產(chǎn)組平均產(chǎn)蛋量為73個,低產(chǎn)組平均產(chǎn)蛋量為22個(表2)。

    2.2 DEGs和DEPs篩選

    經(jīng)過對原始轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,平均每個樣品獲得4.37×107條clean reads,平均注釋效率為90.94%,最終獲得23 324個基因的mRNA表達(dá)量。利用DESeq2包進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析,成功鑒定出450個DEGs,其中有146個基因高產(chǎn)組表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)組,304個基因高產(chǎn)組表達(dá)量顯著低于低產(chǎn)組(圖1A)。

    樣本蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果經(jīng)過定量后獲得8 266個基因的蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)。對兩組樣本的蛋白表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn),共篩選到333個DEPs,其中156個蛋白的表達(dá)量高產(chǎn)組顯著高于低產(chǎn)組,177個蛋白的表達(dá)量高產(chǎn)組顯著低于低產(chǎn)組(圖1B)。

    此外,在DEGs和DEPs聯(lián)合分析中,特別關(guān)注到同時在基因和蛋白層面均表現(xiàn)出差異表達(dá)的交集基因(圖1C),經(jīng)過仔細(xì)比對,共得到8個基因AFAP1、MSC、CFAP206、MRPL51、INHA、FNDC1、INHBB和CNGB1(表3)。值得注意的是,其中AFAP1、INHA、FNDC1、INHBB這4個基因的mRNA和蛋白表達(dá)趨勢完全一致,為后續(xù)的研究提供了重要線索。

    2.3 DEGs、DEPs的功能富集分析

    對DEGs進(jìn)行KEGG富集分析,共富集到108條通路,發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于代謝途徑(metabolic pathways)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway)等通路,其中與卵泡發(fā)育相關(guān)的通路有TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)、GnRH信號通路(GnRH signaling pathway)等。根據(jù)顯著性通路進(jìn)一步篩選到INHBB、BMP5、PTTG1等與調(diào)控產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的DEGs(圖2A)。其中,TGF-β信號通路的分支,激活素通路可能是調(diào)控產(chǎn)蛋的關(guān)鍵通路。在激活素信號通路中,F(xiàn)ST通過作用于抑制素(INHA、INHBB)阻礙激活素與受體相結(jié)合,使SMAD2/3磷酸化增強(qiáng),從而促進(jìn)性腺生長以及胚胎分化(圖3)。對DEPs進(jìn)行KEGG富集分析,共富集到101個相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,排名前50的信號通路(圖2B)顯示,DEPs主要富集于肌動蛋白細(xì)胞骨架(regulation of actin cytoskeleton)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、胰島素信號通路(insulin signaling pathway)、TGF-β信號等通路(TGF-β signaling pathway)等。

    將DEGs和DEPs進(jìn)行共同富集,分析結(jié)果顯示,共有364個顯著的GO條目(209個生物學(xué)過程,61個細(xì)胞組分,94個分子功能)和75個顯著的KEGG通路(圖4)。其中,GO條目主要涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育(gland development)、性別分化(sex differentiation)、性激素活性(hormone activity)等,KEGG通路主要富集到TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、GnRH信號通路(GnRH signaling pathway)、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)等,它們與產(chǎn)蛋性能高度相關(guān),這些相關(guān)條目和通路主要涉及INHBB、FST、BMP5、PITX2、PTTG1、PRKCA、INHA、INSR、PPP3CB、PPP2R5D、EGR1、AKT3和MSC等基因。

    2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

    基于GO和KEGG的分析結(jié)果,將篩出的產(chǎn)蛋性能相關(guān)的候選基因和交集基因,利用在線數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖5),結(jié)果共匹配到38個編碼蛋白,富集到36個節(jié)點(diǎn)。經(jīng)過對網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)中心性的評估與分析,發(fā)現(xiàn)AKT3位于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心,周圍與INSR、INHBB、INHA等多個蛋白節(jié)點(diǎn)連接,從而揭示其在產(chǎn)蛋過程的核心樞紐地位。綜合以上分析,最終確定了AKT3、INSR、INHBB、FST、BMP5、INHA、PPP2R5D、PTTG1、LRP2、TNFSF10、EGR1這11個基因?yàn)楫a(chǎn)蛋性能相關(guān)的核心基因,極有可能與產(chǎn)蛋量之間存在顯著且重要的關(guān)聯(lián)。

    2.5 熒光定量PCR驗(yàn)證

    在產(chǎn)蛋相關(guān)的潛在候選基因中,由于轉(zhuǎn)錄組測序中,AFAP1、INHA、FNDC1基因的FPKM值和原始reads數(shù)值較低,可能對驗(yàn)證結(jié)果的精確性構(gòu)成不利影響,因此,在GO注釋和KEGG分析結(jié)果等的綜合考慮下,決定選擇9個DEGs對高產(chǎn)組和低產(chǎn)組的卵巢組織樣本(每組8個,且包含轉(zhuǎn)錄組測序的樣品)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,以L組為對照做均一化處理,結(jié)果表明,9個基因的表達(dá)量變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相同,并且表達(dá)水平在高低產(chǎn)五龍鵝卵巢組織中均呈現(xiàn)顯著差異,其中PTTG1、PRLHR、TNFSF10、INHBB基因表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)(圖6)。

    3 討 論

    家禽產(chǎn)蛋量與卵泡發(fā)育密切相關(guān),卵泡發(fā)育包括原始卵泡、生長卵泡、成熟卵泡三個階段的發(fā)育,其中涉及生長因子、激素、血管生成和肌肉組織等相關(guān)基因的交互作用。為解析影響產(chǎn)蛋量的分子機(jī)制,本研究利用高、低產(chǎn)蛋水平的五龍鵝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析,篩選與產(chǎn)蛋量相關(guān)的候選基因,為后續(xù)利用分子標(biāo)記輔助育種培育鵝高繁配套系奠定基礎(chǔ)。

    在本研究中,通過對五龍鵝高產(chǎn)組和低產(chǎn)組轉(zhuǎn)錄組和蛋白組差異比較,發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、TGF-β信號(TGF-β signaling pathway)、黏著斑(focal adhesion)等通路。有研究發(fā)現(xiàn),王瑩等[10-11在雞卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組調(diào)控研究中,也顯著富集到GnRH信號通路(GnRH signaling pathway)、鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)等通路。兩者在通路富集結(jié)果種類中有相同之處,進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了這些通路的在卵巢發(fā)育中的重要性。其中,細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)通路可能在促進(jìn)雞卵泡顆粒細(xì)胞增殖起關(guān)鍵作用,而且參與輸卵管的收縮和蛋殼的形成,影響蛋的排出和蛋殼的質(zhì)量[12-13。劉建高14通過蛋白組學(xué)技術(shù)在蛋鴨卵泡發(fā)育調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn),鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)可能通過影響卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡和能量代謝來調(diào)控卵泡的發(fā)育和排卵;并且通過影響輸卵管上皮細(xì)胞的鈣吸收和分泌功能來確保蛋殼的正常形成。MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)的激活可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌FSH(促卵泡激素)和LH(促黃體生成素)受體等多種生長因子和激素,促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育;并且通過調(diào)控卵泡壁細(xì)胞的收縮和卵泡液的分泌,確保卵泡正常破裂釋放卵母細(xì)胞,完成排卵[15。綜上研究表明,這些通路在卵泡發(fā)育、蛋殼形成以及排卵等過程中具有重要作用。

    卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,在這個過程中細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)控作用,卵泡中的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的相互作用以及卵泡微環(huán)境的變化均會影響卵泡的發(fā)育和成熟[16-17。TNFSF10作為一種促凋亡因子,屬于腫瘤壞死因子(TNF)配體家族的成員,通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來清除異?;蚴軗p細(xì)胞,減少炎癥因子的來源,從而間接調(diào)控炎癥反應(yīng)[18。已有研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)[19、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)等通過影響HPO軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)的神經(jīng)內(nèi)分泌活動來調(diào)控卵泡的發(fā)育和排卵。本研究發(fā)現(xiàn),TNFSF10在五龍鵝卵巢的表達(dá)量高產(chǎn)組顯著低于低產(chǎn)組,提示該基因可能在五龍鵝卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用,進(jìn)而對卵泡的發(fā)育產(chǎn)生影響。因此推測,低產(chǎn)組鵝體內(nèi)可能存在炎癥反應(yīng),進(jìn)而影響其卵泡發(fā)育質(zhì)量,導(dǎo)致產(chǎn)蛋量降低。

    卵母細(xì)胞減數(shù)分裂是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的最后一個階段,是受精、胚胎著床前不可或缺的先決條件,PTTG1、PPP2R5D、PPP3CB這3個基因均在此過程中發(fā)揮重要作用。PTTG1在豬胚胎發(fā)生過程中參與卵母細(xì)胞成熟和合子基因組激活的過程[20,并且在馬和驢等動物的GV期和MⅡ期的卵母細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)PTTG1都有高豐度表達(dá)[21。與之相似,本研究也發(fā)現(xiàn)了PTTG1在高產(chǎn)組鵝卵巢中高豐度表達(dá)。由此推測,該基因可能通過促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育,進(jìn)而影響五龍鵝的產(chǎn)蛋水平。此外,PPP2R5D、PPP3CB這兩個基因是磷蛋白磷酸酶(PPP)家族重要成員。有研究證實(shí),PPP3CB參與調(diào)控豬青春期卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程[22,而且,當(dāng)PPP2R5D亞基中的絲氨酸-丙氨酸發(fā)生突變時,會抑制小鼠卵泡的正常去磷酸化23,從而影響正常的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程,提示該基因可能通過干預(yù)卵泡生長發(fā)育影響五龍鵝產(chǎn)蛋水平。

    產(chǎn)蛋量與蛋重之間存在一定的關(guān)系,但這種關(guān)系受多種因素的影響。多項(xiàng)研究證實(shí),蛋重與產(chǎn)蛋量之間存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)[24。Yi等[25也在蛋清形成的膨大部發(fā)現(xiàn),LRP2是影響蛋重的重要基因。LRP2作為一種多功能內(nèi)吞受體[26,通過內(nèi)吞作用有效攝取與其載體蛋白相結(jié)合的重要維生素和激素,包括維生素D結(jié)合蛋白[27、視黃醇結(jié)合蛋白28和性激素結(jié)合球蛋白29-30等,這些物質(zhì)的攝取對卵巢的發(fā)育具有重要作用。當(dāng)維生素D攝取不足時,會影響抗繆勒管激素的分泌,這是一種由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的激素,對卵巢的儲備功能和排卵過程有重要影響[31-33。此外,維生素D的缺乏還可能導(dǎo)致生殖系統(tǒng)微血管功能異常,影響子宮內(nèi)膜的營養(yǎng)供應(yīng)和修復(fù)過程,從而影響卵巢的正常功能[34。因此,LRP2作為母胎脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的胚胎脂蛋白受體,介導(dǎo)脂蛋白攝取到卵黃囊中,對卵泡的發(fā)育具有重要意義。在本研究中,低產(chǎn)組LRP2表達(dá)量顯著高于高產(chǎn)組,這種高表達(dá)促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)向卵泡的有效輸送,確保了卵泡發(fā)育過程中獲得充足的營養(yǎng)支持。因此,這種營養(yǎng)分配的差異可能是導(dǎo)致低產(chǎn)鵝的種蛋較重、產(chǎn)蛋量較低的重要因素之一。

    通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得知,INHBB、INHA、FST(卵泡抑素)這3個基因相互之間有著密切的關(guān)聯(lián),有研究證實(shí)其在影響產(chǎn)蛋性狀中起重要作用。在雌性動物卵巢發(fā)育過程中,抑制素、激活素和卵泡抑素都是重要的調(diào)節(jié)因子,這三者組成的抑制素-激活素-卵泡抑素系統(tǒng)在動物的各個生殖階段都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用35。有研究證實(shí),在激活素信號通路中,F(xiàn)ST作用于抑制素,從而阻止激活素與其受體的結(jié)合36,導(dǎo)致SMAD2/3磷酸化增強(qiáng),這進(jìn)一步促進(jìn)了性腺的生長和胚胎的分化(圖3)[37-38。本研究中,這3個基因在高產(chǎn)組的mRNA表達(dá)水平高于低產(chǎn)組,當(dāng)敲除INHBB時,會影響顆粒細(xì)胞的生長和凋亡39-40,而過表達(dá)時,其會和FSH相互作用影響類固醇激素下調(diào),導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻41。當(dāng)然,在正常情況下,一定水平的INHBB會適當(dāng)?shù)囊种艶SH分泌。由此推斷,在產(chǎn)蛋過程中,這3個基因通過促進(jìn)性腺生長發(fā)育和調(diào)控生殖激素平衡,從而促進(jìn)產(chǎn)蛋量增加。

    4 結(jié) 論

    本研究通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進(jìn)行聯(lián)合分析,最終篩選到6個與產(chǎn)蛋性能相關(guān)的候選基因(PTTG1、LRP2、TNFSF10、INHA、INHBB、FST),為五龍鵝產(chǎn)蛋性能的分子育種和產(chǎn)蛋性能調(diào)控機(jī)制的闡明提供參考。

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    (編輯 郭云雁)

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