植物雌激素大豆黃酮對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成和細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

摘 要： 本試驗(yàn)旨在研究植物雌激素大豆黃酮（daidzein， DZ）對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞EpH4-Ev乳糖、乳蛋白、乳脂肪合成及細(xì)胞增殖的影響，探討相關(guān)的調(diào)節(jié)作用。首先用不同濃度DZ（0～1 000 μmol·L^-1）處理EpH4-Ev細(xì)胞6、12、24、48 h，通過檢測(cè)細(xì)胞活力確定DZ作用濃度及時(shí)間；試驗(yàn)分為對(duì)照組（0 μmol·L^-1 DZ處理）、低濃度組（10 μmol·L^-1 DZ處理）、中濃度組（20 μmol·L^-1 DZ處理）、高濃度組（40 μmol·L^-1 DZ處理），并以生理劑量的雌二醇（E2）作為陽性對(duì)照，37 ℃、5%CO 2培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行如下試驗(yàn)：1）測(cè)定細(xì)胞及分泌上清中甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）含量及脂滴染色變化；2）檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白、乳成分合成相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；3）檢測(cè)PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平；4）流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示：1）與對(duì)照組相比，2.5～80.0 μmol·L^-1 "DZ處理后，細(xì)胞活力極顯著提高（Plt;0.01），其中20 μmol·L^-1 DZ處理提高效果最為顯著，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果，選擇DZ作用的低、中和高濃度分別為10、20和40 μmol·L^- 作用時(shí)間為12 h。2）與對(duì)照組相比，中濃度及高濃度組DZ及E2處理后極顯著提高了EpH4-Ev細(xì)胞及分泌上清中TG和GLU的含量，促進(jìn)了脂滴的合成（P＜0.01）。3）與對(duì)照組相比，不同濃度DZ處理后葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（GLUT1）和β-酪蛋白（β-casein）的表達(dá)均極顯著升高（P＜0.01）；同時(shí)DZ及E2處理后均提高脂肪酸合成酶（FASN）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的表達(dá)。4）與對(duì)照組相比，不同濃度DZ及E2處理后均增加了G2/M期和S期的細(xì)胞占比，上調(diào)了增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白D1、D3、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量，同時(shí)中濃度DZ組極顯著增加了Bcl-2/Bax比值（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率降低。5）三個(gè)濃度DZ及E2處理后均上調(diào)了PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路中p-PI3K、p-mTOR、p-AKT的磷酸化水平。結(jié)果表明：DZ處理可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖及乳成分的合成。其機(jī)制與上調(diào)細(xì)胞增殖蛋白的表達(dá)、降低細(xì)胞凋亡率，激活PI3K/AKT-mTOR通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 植物雌激素；大豆黃酮；小鼠乳腺上皮細(xì)胞；乳成分合成；乳腺上皮細(xì)胞的增殖

中圖分類號(hào)： S857.26"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0417-13

收稿日期：2024-02-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31972640）

作者簡(jiǎn)介：黃心河（1999-），女，浙江常山人，碩士，主要從事動(dòng)物機(jī)能生物化學(xué)研究，E-mail： 2021107033@stu.njau.edu.cn

*通信作者：張?jiān)词?，主要從事?dòng)物機(jī)能生物化學(xué)研究，E-mail： zhangyuanshu@njau.edu.cn

Effects and Mechanism on the Synthesis of Milk Components and Cell Proliferation in Mouse

Mammary Epithelial Cells by Phytoestrogen Daidzein

HUANG" Xinhe， LI" Haonan， ZHOU" Xiao， XU" Jiajing， ZHANG" Yuanshu*， HAN" Zhengkang

（Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry of Ministry of Agriculture and

Rural Affairs， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： "This study was to detect the effects of Daidzein （DZ） on the synthesis of lactose， milk protein， milk fat and cell proliferation of mouse mammary epithelial cells EpH4-Ev to investigate the associated regulatory roles. EpH4-Ev cells were treated with different concentrations of DZ （0 to 1 000 μmol·L^-1） for 6， 12， 24， 48 h and the concentration of DZ and time were determined by detecting cell viability; they were divided into a control group （0 μmol·L^-1 DZ treatment）， a low-concentration group （10 μmol·L^-1 DZ treatment）， a medium-concentration group （20 μmol·L^-1 DZ treatment）， and a high-concentration group （40 μmol·L^-1 DZ treatment）， and physiological dose of estradiol （E2） was used as a positive control， and the cells were incubated for 12 h at 37 ℃ and 5% CO 2 as follows experiments were performed： 1） Determination of triglyceride （TG） and glucose （GLU） content in cells and supernatants; 2） Cell proliferation and apoptosis-related proteins， milk component synthesis-related proteins and PI3K/AKT-mTOR signaling pathways were detected， and milk lipid synthesis was probed by combining with lipid droplet staining. The apoptosis rate and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. The results showed that： 1） Compared with the control group， between 2.5-80.0 μmol·L^-1 DZ treatments could significantly improve the cell viability of EpH4-Ev cells （Plt;0.01）， and 20 μmol·L^-1 DZ treatment had the most significant improvement effect. Combined with the results of the pre-laboratory period， the low， medium and high concentrations of DZ action were selected to be 10， 20， and 40 μmol·L^-1. 2） Compared with the control group， medium and high concentration of DZ and E2 treatments significantly increased the content of TG and GLU in EpH4-Ev and supernatants and promoted the synthesis of lipid droplets （Plt;0.01）. 3） Compared with the control group， the expression of glucose transporter carrier 1 （GLUT1） and β-casein were both highly significantly elevated after treatment with different concentrations of DZ （Plt;0.01）; meanwhile， both DZ and E2 treatments increased the expression of fatty acid synthetase （FASN）， cholesterol regulatory element-binding protein 1 （SREBP1）， peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPAR-γ）， and acetyl coenzyme A carboxylase （ACC） expression. 4） Compared with the control group， the proportion of cells in G2/M phase and S phase， the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， cell cycle proteins D1 and D3 （CyclinD1 and D3）， and anti-apoptotic protein Bcl-2 were increased after treatment with different concentrations of DZ and E2， and the medium concentration of DZ group highly significantly increased the Bcl-2/Bax ratio （Plt;0.01） and decreased the apoptosis rate. 5） Compared with the control group， three concentrations of DZ and E2 treatment increased the phosphorylation levels of p-PI3K， p-mTOR， p-AKT and promoted the activation of the PI3K/AKT-mTOR signaling pathway. These results suggested that DZ can promote the proliferation of mammary epithelial cells and the synthesis of milk components. The mechanism is related to the up-regulation of the expression of cell proliferation proteins， the reduction of apoptosis rate， and the activation of PI3K/AKT-mTOR pathway.

Key words： phytoestrogen; daidzein; mouse mammary epithelial cells; milk component synthesis; mammary epithelial cell proliferation

*Corresponding author：" ZHANG Yuanshu， E-mail： zhangyuanshu@njau.edu.cn

乳腺是哺乳動(dòng)物乳汁合成和分泌的場(chǎng)所，乳汁作為哺乳動(dòng)物初生后代的主要營(yíng)養(yǎng)來源，為后代的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。乳腺上皮細(xì)胞（mammary epithelial cells， MECs）發(fā)揮分泌功能，使乳腺產(chǎn)生乳汁，其數(shù)量及分泌活性是影響乳腺泌乳量的重要因素之一。另外，乳腺上皮細(xì)胞的增殖和凋亡與泌乳和乳腺發(fā)育密切相關(guān)對(duì)乳汁生產(chǎn)至關(guān)重要^［1］。乳汁的主要成分為乳糖、乳脂和乳蛋白^［2］。乳糖是主要的能量來源，是影響乳產(chǎn)量高低的決定因素。乳脂含量是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其在乳汁能量分配方面也發(fā)揮著核心作用。乳蛋白包含機(jī)體大部分的必需氨基酸，同樣是衡量乳品質(zhì)量的重要指標(biāo)。乳成分和泌乳量作為衡量乳用動(dòng)物生產(chǎn)性能和乳品質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接影響著乳用動(dòng)物的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。乳腺是乳用動(dòng)物泌乳的唯一場(chǎng)所，它的健康發(fā)育直接關(guān)系母畜后期泌乳的乳品質(zhì)。對(duì)乳腺的泌乳及乳成分進(jìn)行研究具有十分重要的意義。

有研究指出，雌激素可以通過刺激垂體前葉合成并釋放PRL，共同調(diào)控乳成分的合成^［3］。Chu等^［4］研究發(fā)現(xiàn)，17-β-雌二醇（17-β-estradiol， E2）通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成酶促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的脂質(zhì)合成。Burgos等^［5］研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中添加催乳素（PRL）、雌激素（E）、胰島素和氫化可的松等能夠提高乳蛋白的合成量。Tucker等^［6］研究發(fā)現(xiàn)，一定量的雌激素可以刺激泌乳，而過量的雌激素會(huì)抑制泌乳。但是，雌激素在體內(nèi)易殘留且有毒害作用，易導(dǎo)致乳腺發(fā)育不全，尋找雌激素的替代品是一個(gè)新的思路和方向。

植物雌激素是在各種植物來源中發(fā)現(xiàn)的類雌激素化合物，其中的大豆黃酮（daidzein， DZ）屬于異黃酮類植物雌激素，其結(jié)構(gòu)與E2相似。有研究發(fā)現(xiàn)，其可以與雌激素受體相互作用，在體內(nèi)發(fā)揮雌激素或抗雌激素活性^［7］。另有研究表明，DZ可與多種激素協(xié)同作用促進(jìn)乳腺泌乳及酪蛋白的合成^［8］。謝娜娜等^［9］及本實(shí)驗(yàn)室前期研究均發(fā)現(xiàn)DZ可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖和乳腺發(fā)育^［10］，顯示了DZ在調(diào)控乳腺發(fā)育方面的開發(fā)潛力。但至目前，關(guān)于DZ對(duì)乳成分合成的影響及機(jī)理方面的研究較少，所得的結(jié)果尚不一致。本試驗(yàn)擬以DZ處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞EpH4-Ev，研究DZ對(duì)EpH4-Ev乳成分合成及細(xì)胞增殖的影響，并通過PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路初步探討其作用機(jī)制，旨在為DZ調(diào)控乳成分合成提供理論數(shù)據(jù)資料，同時(shí)為進(jìn)一步在乳用動(dòng)物和奶業(yè)生產(chǎn)中植物雌激素大豆黃酮的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆黃酮（daidzein， DZ）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)韓正康教授贈(zèng)送（純度≥98%）；Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒購(gòu)自上海陶術(shù)生化科技有限公司；細(xì)胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF均購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司；甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司；小鼠乳腺上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海翌圣生物科技公司；尼羅紅（Nile Red）染料購(gòu)自MCE公司等。

細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinD3、β-tubulin抗體均購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司；乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、Bax、Bcl-2、mTOR、p-mTOR抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（GLUT1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體均購(gòu)自武漢三鷹公司；PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、β-酪蛋白（β-casein）抗體均購(gòu)自Immunoway公司；脂肪酸合成酶（FAS）抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物科技公司；膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）抗體、羊抗兔IgG購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司。ECL顯色液、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期試劑盒均購(gòu)自翌圣生物科技公司等。

1.2 儀器與設(shè)備

POWER-PAC 300 電泳儀（BIO-RAD，美國(guó)）、POWER-PACHC 轉(zhuǎn)印儀（BIO-RAD，美國(guó)）、Tanon-3900 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海 Tanon 科技有限公司，中國(guó)）、Tecan Spark 多功能酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）；EVOS M7000 倒置熒光顯微鏡（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)）、BECKMAN-CytoFLEX流式細(xì)胞儀（BECKMAN，美國(guó)）等。

1.3 細(xì)胞及培養(yǎng)

小鼠乳腺上皮細(xì)胞（EpH4-Ev）來自于實(shí)驗(yàn)室存種。常規(guī)法培養(yǎng)，使用專用培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO 2條件下傳代培養(yǎng)。所有細(xì)胞處理前均用未加胎牛血清的不完全培養(yǎng)基饑餓處理4 h。

1.4 試驗(yàn)分組及細(xì)胞處理

1.4.1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度DZ對(duì)乳腺上皮細(xì)胞活力的影響

參照謝娜娜等^［9］的方法，采用CCK-8法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞活力。當(dāng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，分別加入終濃度為0、2.5、5、10、20、40、80、160、1 000 μmol·L^-1的DZ處理細(xì)胞6、12、24、48 h，更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每孔加入10 μL CCK-8試劑并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)下的吸光度（OD）值，按以下公式計(jì)算：

細(xì)胞活力=（樣品孔吸光度-空白孔吸光度）÷（對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度）。

1.4.2 試驗(yàn)分組

正常消化細(xì)胞制成懸液，均勻接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，根據(jù)CCK-8試驗(yàn)確定的作用條件，如表1進(jìn)行分組與處理，37℃、5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。陽性對(duì)照組以E2處理，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 細(xì)胞甘油三酯和葡萄糖含量的測(cè)定

6孔板細(xì)胞處理12 h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清后，使用裂解液刮下細(xì)胞并超聲破碎。按甘油三酯和葡萄糖試劑盒說明書操作，分別在500及505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，按照說明書分別計(jì)算細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和葡萄糖的含量。

1.5.2 脂滴觀察與含量的測(cè)定

免疫熒光法檢測(cè)。具體取長(zhǎng)至80%左右的細(xì)胞正常消化，制成細(xì)胞懸液，均勻鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，高、中、低三個(gè)濃度DZ處理12 h，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)孔，處理結(jié)束后，每孔加入10 μL的尼羅紅染料，37℃，孵育10 min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌，之后熒光顯微鏡下觀察脂滴含量并結(jié)合Image J分析。

1.5.3 細(xì)胞增殖與凋亡、乳成分合成及PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平檢測(cè)

采用Western blot法測(cè)定。具體操作如下：6孔板細(xì)胞處理12 h后終止培養(yǎng)，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，并用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞。4 ℃ 12 000 g離心10 min，收集細(xì)胞上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，統(tǒng)一濃度后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min制樣。每孔上樣10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE，然后濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗CyclinD1、CyclinD3、ACC、mTOR、p-mTOR、β-casein、GLUT1、PCNA、FASN、SREBP1、PPAR-γ、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（皆為1∶1 000稀釋）及β-tubulin（1∶10 000稀釋），抗體與蛋白條帶在4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的1∶10 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。洗滌后加入ECL發(fā)光液，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，Image J軟件分析各條帶灰度值。以β-tubulin為內(nèi)參比較并計(jì)算各目的條帶相對(duì)灰度值。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DZ對(duì)乳腺細(xì)胞凋亡的影響

參照Kumar和Chauhan^［11］的方法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理細(xì)胞中凋亡水平的變化。具體步驟如下：細(xì)胞消化后，4℃ 300 g離心5 min，收集細(xì)胞；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，離心后收集細(xì)胞，用緩沖液重懸細(xì)胞。之后在每管細(xì)胞中加入染色工作液，室溫避光孵育15 min，再次用緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀和FlowJo_V10.0軟件檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡率和壞死率。

1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況

細(xì)胞處理結(jié)束后，消化并收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次；棄去PBS，加入70%的預(yù)冷乙醇，4 ℃固定過夜；次日離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入PBS重懸細(xì)胞。之后加入2 μL的RNase A，37℃水浴30 min；再加入50 μL的碘化丙啶（PI）染色液，室溫避光孵育20 min后上機(jī)檢測(cè)，采用Modfit 5.0軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），GraphPad Prism 8.0軟件作圖，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±s x-）”表示，Plt;0.05 表示差異顯著，Plt;0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DZ對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力的影響

結(jié)果如圖1 所示，與對(duì)照組相比，2.5～160 μmol·L^-1的DZ處理EpH4-Ev細(xì)胞6、12、24 h均未引起細(xì)胞活力的顯著下降，表明此條件DZ對(duì)小鼠EpH4-Ev細(xì)胞的無毒副作用；同時(shí)在2.5～80 μmol·L^-1不同濃度DZ處理后，細(xì)胞活力均極顯著提高（Plt;0.01），而處理48 h各濃度DZ處理均極顯著降低了細(xì)胞活力（Plt;0.01）。綜合實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果，本試驗(yàn)選擇10、20及40 μmol·L^-1 DZ濃度分別作為低、中、高濃度用于后續(xù)試驗(yàn)，處理時(shí)間選擇12 h。

2.2 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量的影響

結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后，EpH4-Ev分泌上清（圖2A）及細(xì)胞（圖2B）中的甘油三酯含量均有升高，中濃度和高濃度組極顯著升高（P＜0.01），且均高于E2處理組。

2.3 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞葡萄糖含量的影響

結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后各組細(xì)胞分泌上清及細(xì)胞中葡萄糖含量均極顯著升高（P＜0.01），且隨著DZ濃度提高，細(xì)胞中葡萄糖含量呈劑量依賴性升高。

2.4 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞脂滴合成的影響

結(jié)果如圖4所示，根據(jù)所拍攝的熒光圖，每組分別選取10個(gè)200倍放大的視野，利用Image J軟件計(jì)算每個(gè)視野中脂滴的數(shù)量，最后結(jié)果以統(tǒng)計(jì)圖的形式表示。乳脂可以脂滴的形式貯存起來，成份包括甘油三酯和膽固醇酯等。細(xì)胞脂滴染色情況結(jié)合脂滴光密度分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后小鼠乳腺上皮細(xì)胞中脂滴亮度明顯提高且含量升高，中、高濃度DZ組脂滴含量極顯著升高（P＜0.01）。

2.5 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖5A所示。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體1作為小鼠乳腺中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，能促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞，進(jìn)而合成乳糖。與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后GLUT1的表達(dá)均極顯著升高（P＜0.01），且隨著DZ濃度的升高，其表達(dá)呈劑量依賴性提高。

β-酪蛋白作為乳蛋白中含量最多的一種蛋白，其表達(dá)情況反映了乳蛋白的合成情況。與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后β-casein表達(dá)均極顯著升高（P＜0.01），且中濃度組最為顯著，隨DZ濃度的進(jìn)一步升高，其表達(dá)開始降低（圖5B）。

乳脂合成相關(guān)蛋白FASN、ACC、SREBP1、PPAR-γ的表達(dá)結(jié)果見圖5C～F，DZ及E2處理后均提高了以上蛋白的表達(dá)，中濃度組極顯著提高了FASN、SREBP1、PPAR-γ的表達(dá)（P＜0.01），高濃度組極顯著提高了FASN、ACC、SREBP1的表達(dá)（P＜0.01）。

2.6 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞周期分布的影響

DZ處理對(duì)乳腺上皮細(xì)胞周期分布的變化結(jié)果如圖6所示。與對(duì)照組相比，各濃度DZ處理組及E2均降低了G0/G1期細(xì)胞占比，增加了S期和G2/M期細(xì)胞比例。其中低濃度及高濃度組均極顯著降低了G0/G1期細(xì)胞占比（Plt;0.01），極顯著增加S期比例（Plt;0.01）；中濃度組顯著增加G2/M期細(xì)胞占比（Plt;0.05）。E2組與中濃度組具有相同趨勢(shì)，但對(duì)G2/M期細(xì)胞比例的增加未達(dá)到顯著水平（Pgt;0.05）。

2.7 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡率的影響

DZ處理對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡率的變化結(jié)果如圖7所示。Q1區(qū)（Annexin V-FITC）-/ PI+ 此區(qū)域?yàn)閴乃兰?xì)胞；Q2區(qū)（Annexin V-FITC）+/PI+ 此區(qū)域?yàn)橥砥诘蛲黾?xì)胞；Q3區(qū)（Annexin V-FITC）+/PI- 此區(qū)域?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞；Q4區(qū)（Annexin V-FITC）-/PI- 此區(qū)域?yàn)榛罴?xì)胞。Q2區(qū)與Q3區(qū)所占百分比表示細(xì)胞凋亡水平的變化。

與對(duì)照組相比，低濃度組DZ與E2組極顯著或顯著降低了細(xì)胞凋亡率（P＜0.01或 P＜0.05），中濃度組降低了凋亡率但差異不顯著（P＞0.05），而高濃度組極顯著提高了細(xì)胞的凋亡率（P＜0.01），促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

2.8 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后均提高了增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中不同濃度DZ及E2處理后均極顯著提高了PCNA蛋白的表達(dá)（P＜0.01）；低濃度與中濃度組DZ及E2處理顯著或極顯著提高了細(xì)胞周期蛋白D1、D3的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），高濃度組DZ處理后同樣上調(diào)了兩者的表達(dá)，但差異不顯著（P＞0.05）。

與對(duì)照組相比，DZ及E2處理后均提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，中濃度組DZ顯著上調(diào)（P＜0.05）；高濃度組DZ與E2處理后極顯著提高了凋亡蛋白Bax的表達(dá)（P＜0.01）；中濃度組極顯著增加了Bcl-2/Bax比值（P＜0.01），高濃度組及E2組極顯著降低了Bcl-2/Bax比值（P＜0.01）。

2.9 DZ處理對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的影響

結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組相比，三個(gè)濃度DZ處理均極顯著增加了p-AKT的磷酸化水平（P＜0.01），不同濃度DZ及E2處理后同樣增加了p-PI3K和p-mTOR蛋白磷酸化水平，其中低濃度、中濃度組及E2處理組極顯著促進(jìn)了p-PI3K蛋白的磷酸化（P＜0.01）；中、高濃度組及E2處理組極顯著促進(jìn)了p-mTOR蛋白的磷酸化（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，中濃度組DZ極顯著激活了PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路。

3 討 論

3.1 DZ對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響

細(xì)胞增殖是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。乳腺發(fā)育過程中，細(xì)胞增殖與分化對(duì)乳腺組織的生長(zhǎng)和泌乳均發(fā)揮了重要調(diào)控作用。乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量與泌乳量密切相關(guān)，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖可以增加泌乳量^［2］。細(xì)胞周期蛋白D1、D3（Cyclin D1、D3）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物，在調(diào)控細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用^［12］。Cyclin D是有絲分裂的重要傳感器，可通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4或CDK6結(jié)合，控制G1、G1/S期的轉(zhuǎn)換，從而啟動(dòng)DNA復(fù)制^［13］。其中Cyclin D1、Cyclin D3是Cyclin D的兩個(gè)重要亞型，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1-S期進(jìn)程的關(guān)鍵周期蛋白。細(xì)胞增殖抗原PCNA是一種在DNA損傷和修復(fù)中起主要作用的核蛋白。

有研究發(fā)現(xiàn)PCNA在S期表達(dá)顯著增加，可作為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，促進(jìn)DNA復(fù)制^［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)雌激素E2在哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育過程中具有重要作用，可調(diào)節(jié)導(dǎo)管形態(tài)發(fā)生，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖^［15］。DZ作為植物雌激素，具有相似的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。劉春龍等^［10］發(fā)現(xiàn)，DZ在一定濃度范圍內(nèi)顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖。異黃酮類植物雌激素可通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白信號(hào)通路來影響乳腺的發(fā)育^［16］。研究發(fā)現(xiàn)DZ可通過上調(diào)Cyclin D1蛋白的表達(dá)并增加G2/M期細(xì)胞占比從而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖^{［9，17］}。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DZ處理后提高了小鼠乳腺上皮細(xì)胞中Cyclin D1、D3、PCNA蛋白的表達(dá)量，同時(shí)提高了G2/M期和S期細(xì)胞的占比，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，與以往研究結(jié)果一致，提示著DZ處理可促進(jìn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖。

細(xì)胞的增殖和凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程。Bcl-2相關(guān)蛋白是影響細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)介導(dǎo)者，抗凋亡Bcl-2基因缺乏會(huì)加速細(xì)胞凋亡，促凋亡Bax基因缺失會(huì)延緩乳腺的退化^［18］。在細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白之間是相互拮抗的，細(xì)胞凋亡由Bcl-2/Bax比率的變化調(diào)節(jié)^［19］。因此，通常用Bcl-2/Bax比值來檢測(cè)細(xì)胞凋亡效應(yīng)。Kumar和Chauhan^［11］研究發(fā)現(xiàn)，DZ可通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑影響B(tài)ax/Bcl-2蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，中濃度DZ處理后顯著上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低了凋亡蛋白Bax的表達(dá)，極顯著增加了Bcl-2/Bax比值。同時(shí)經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Annexin V 凋亡細(xì)胞所占百分比，發(fā)現(xiàn)中濃度的DZ可降低乳腺上皮細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)細(xì)胞存活。綜上結(jié)果表明，中濃度DZ 可有效抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。

3.2 DZ對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成的影響

乳汁作為哺乳動(dòng)物初生幼仔的主要營(yíng)養(yǎng)來源，可以為幼仔提供必要的營(yíng)養(yǎng)和具有生物活性的化合物，促進(jìn)幼仔的生長(zhǎng)發(fā)育，并增強(qiáng)機(jī)體免疫力^［20］。各種哺乳動(dòng)物乳汁中都包含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、無機(jī)鹽和維生素等^［2］。乳汁中的蛋白質(zhì)主要為酪蛋白（casein），占比高達(dá)80%，包括αS、β、γ和κ等不同表型^［21］。其中β-casein是乳中主要的酪蛋白，可通過檢測(cè)酪蛋白的表達(dá)量來判斷乳腺細(xì)胞的乳蛋白合成能力^［2］ 。Tsugami等^［22］研究發(fā)現(xiàn)異黃酮及其代謝物可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌酪蛋白。本研究結(jié)果顯示不同濃度DZ處理后均極顯著提高了小鼠乳腺上皮細(xì)胞中β-casein蛋白的表達(dá)，其中以中濃度DZ影響效果最為顯著。

乳糖作為乳汁中重要的組成成分，是控制乳汁體積的關(guān)鍵，Shahbazkia等^［23］研究發(fā)現(xiàn)乳糖合成水平與泌乳量、乳蛋白以及總固形物產(chǎn)量正相關(guān)。乳糖的生物合成主要在乳腺上皮細(xì)胞中的高爾基體內(nèi)進(jìn)行，以葡萄糖作為乳糖合成的主要前體物，能夠?yàn)槿樘翘峁?0%～85%的碳源^［24］。由于乳腺內(nèi)缺少葡萄糖-6-磷酸酶，不能通過糖異生合成葡萄糖，乳腺內(nèi)所需的葡萄糖主要從細(xì)胞外攝取。GLUT1是小鼠乳腺中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，當(dāng)GLUT1表達(dá)下調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致用于合成乳糖的葡萄糖利用率降低^［25］。本研究發(fā)現(xiàn)DZ處理后極顯著提高了小鼠乳腺上皮細(xì)胞中及細(xì)胞分泌的葡萄糖的含量，同時(shí)極顯著提高了GLUT1蛋白的表達(dá)，提示：DZ對(duì)乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及利用葡萄糖具有促進(jìn)作用，從而促進(jìn)乳糖的合成。

脂類為乳中重要營(yíng)養(yǎng)成分之一，其主要成分為甘油三酯（triglyceride， TG），在乳脂中質(zhì)量百分比約占98%。甘油和葡萄糖代謝途徑中產(chǎn)生的脂肪酸合成甘油三酯，隨后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成脂滴，在脂質(zhì)包裹下釋放入腺泡腔中，乳脂主要以與膜結(jié)合的小球形式存在^［2］。甘油三酯在很大程度上決定了乳脂的合成量，因此常用作乳脂含量的指標(biāo)。在乳脂合成和分泌過程中，涉及許多基因的表達(dá)調(diào)控，其中PPAR γ和SREBP1是乳脂合成相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。研究表明，激活的SREBP1可通過結(jié)合脂肪酸合成酶ACC、FAS等基因的應(yīng)答元件，從而激活脂肪生成基因的轉(zhuǎn)錄以及乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸從頭合成和三?；视头e累，促進(jìn)乳脂合成^［26-27］ 。PPAR γ作為乳脂合成的正調(diào)節(jié)因子，在乳成分合成過程中，能增加乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)TG的含量^［28］，同時(shí)通過調(diào)節(jié)乳腺中生脂相關(guān)基因的表達(dá)及SREBP1的表達(dá)繼而促進(jìn)乳脂的合成^［29-30］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DZ處理后顯著提高了乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞分泌的甘油三酯的含量及脂滴含量，同時(shí)上調(diào)了乳脂合成相關(guān)蛋白ACC、FASN、SREBP1、PPAR-γ的表達(dá)，提示DZ具有促進(jìn)乳脂合成的作用，且這種作用與PPAR γ和SREBP1的激活有關(guān)。

3.3 DZ對(duì)PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路的影響

PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路參與細(xì)胞存活、生長(zhǎng)增殖和組織器官的形成等多種生命進(jìn)程。AKT被PI3K激活并發(fā)生磷酸化后，可作用于mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)；同時(shí)通過激活并磷酸化CDK的抑制劑p21和p27，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。此外AKT是細(xì)胞存活的主要調(diào)節(jié)因子，通過直接抑制促凋亡蛋白（如Bad）或抑制轉(zhuǎn)錄因子（如FoxO1）產(chǎn)生促凋亡的信號(hào)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)^［31］。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá) AKT可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖^［32］。在乳腺上皮細(xì)胞中該信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)^［33］，此外研究發(fā)現(xiàn)該通路可調(diào)控乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)參與乳脂合成的調(diào)控過程，提高乳脂合成信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)^［34］。此外，該信號(hào)通路還涉及到乳糖合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)SIRT7可調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白、乳脂和乳糖合成的關(guān)鍵基因表達(dá)，而這些調(diào)控作用可能與PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路有關(guān)^［28］。Yu等^［17］研究發(fā)現(xiàn)DZ可通過NFκB1激活來增強(qiáng)mTOR-CyclinD1-SREBP-1c信號(hào)通路，從而促進(jìn)乳汁合成和奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。謝娜娜等^［9］研究發(fā)現(xiàn)，DZ可通過激活PI3K-GSK3β-AKT信號(hào)通路來促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。另有研究表明，DZ可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖^［35］。目前關(guān)于DZ、PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路及乳成分合成三者之間的研究較少，多集中于DZ與該通路在乳腺癌的防治研究中。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度DZ及E2處理后均增加p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白磷酸化水平，激活PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路，其中以中濃度（20 μmol·L^-1）DZ效果最為顯著；同時(shí)DZ處理后乳脂乳糖乳蛋白等乳成分的合成均在增加，猜測(cè)DZ可能是通過激活PI3K/AKT-mTOR通路來促進(jìn)乳成分合成。

4 結(jié) 論

植物雌激素DZ可通過激活PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路促進(jìn)小鼠EpH4-Ev乳腺上皮細(xì)胞的增殖、乳蛋白及乳脂的合成，可促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞及利用，共同促進(jìn)乳成分合成。以20 μmol·L^-1 DZ濃度時(shí)，效果較好。

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（編輯 白永平）