豬源大腸桿菌高致病性毒力島結(jié)構(gòu)基因進(jìn)化分析及其對TNF/NF-κB通路的影響

摘 要： 旨在研究豬源大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）高致病性毒力島（high pathogenicity island，HPI）結(jié)構(gòu)基因的進(jìn)化趨勢及其對TNF/NF-κB通路的影響。本研究運用MEGA等軟件分析HPI結(jié)構(gòu)基因的遺傳進(jìn)化，使用R語言功能包挖掘E.coli感染細(xì)胞的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO），并進(jìn)行差異基因富集分析；使用分子對接預(yù)測HPI-Ybt與TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白的結(jié)合；將E. coli及前期構(gòu)建的HPI缺陷株E.coliΔHPI感染IPEC-J2細(xì)胞，運用qPCR、ELISA和Western blot對TNF/NF-κB通路中的關(guān)鍵調(diào)控點進(jìn)行檢測。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，分離株YUNNAN001的intb基因與GQ891729.1親緣關(guān)系最近，而與CQ903045.1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。KEGG富集發(fā)現(xiàn)TNF和NF-κB通路均參與了E. coli感染，且共同基因有10個；火山圖及熱圖富集顯示，E. coli感染顯著促進(jìn)了TNF/NF-κB通路中PTGS2、NF-κB、TRAF6等的表達(dá)（Plt;0.05）；分子對接顯示，HPI-Ybt能與同屬于TNF/NF-κB通路的10個蛋白相結(jié)合，其中與MAP3K14、TNFAIP3的結(jié)合最強(qiáng)；感染E. coli組的NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6 mRNA水平顯著高于E. coliΔHPI組（Plt;0.01），且相對于E. coliΔHPI組，E. coli組顯著激活了TNF/NF-κB通路蛋白的表達(dá)；此外，與E. coliΔHPI組相比，E. coli感染顯著升高了NF-κB和IL-6的水平（Plt;0.01）。結(jié)果提示，E. coli-HPI通過合成Ybt結(jié)合TNF/NF-κB通路中的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而激活TNF/NF-κB通路。

關(guān)鍵詞： 大腸桿菌；高致病性毒力島；耶爾森桿菌素；進(jìn)化分析；TNF/NF-κB信號通路

中圖分類號： S852.612"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0392-12

收稿日期：2024-03-01

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（31960692；31660704）；2021年度云南省研究生優(yōu)質(zhì)課程建設(shè)項目（2021YJSYZKC05）

作者簡介：王 浩（1996-），男，云南普洱人，博士生，主要從事分子病理學(xué)研究；王世玉（1993-），女，云南昭通人，碩士生，主要從事分子病理學(xué)研究。王浩和王世玉為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：高 洪，主要從事分子病理學(xué)研究，E-mail： gaohongping@163.com；肖 鵬，主要從事分子病理學(xué)研究，E-mail： aipengpengpiao@163.com

Evolutionary Analysis of High Pathogenicity Virulence Island Structure Gene of Escherichia

coli from Pigs and Its Effect on TNF/NF-κB Pathway

WANG" Hao WANG" Shiyu2， XIAO" Jinlong2， SHEN" Jue2， PAN" Tianling2， ZHANG" Jingsong2， XIAO" Peng ， GAO" Hong

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 65020" China;

2.College of Veterinary Medicine， Yunnan Agricultural University， Kunming 65020" China）

Abstract： "This study was designed to study the evolutionary trend of structural genes of high pathogenicity island （HPI） of Escherichia coli （E. coli） and its effect on TNF/NF-κB pathway. In this study， MEGA and other software were used to analyze the genetic evolution of HPI structural genes， and R language function package was used to mine the gene expression omnibus （GEO） of E. coli infected cells， and differential gene enrichment analysis was performed. Molecular docking was used to predict the binding of HPI-Ybt to TNF/NF-κB pathway related proteins. E. coli and the previously constructed HPI deficient strain E. coliΔHPI were infected with IPEC-J2 cells， and qPCR， ELISA and Western blot were used to detect the key regulatory points in TNF/NF-κB pathway. Phylogenetic analysis showed that the intb gene of isolate YUNNAN001 was most closely related to GQ891729. but far from CQ903045.1. KEGG enrichment found that TNF and NF-κB pathways were both involved in E. coli infection， and there were 10 common genes. Volcano plot and heat map enrichment showed that E. coli infection significantly promoted the expression of PTGS2， NF-κB， TRAF6 and other proteins in TNF/NF-κB pathway （Plt;0.05）. Molecular docking showed that HPI-Ybt could bind to 10 proteins belonging to TNF/NF-κB pathway， among which MAP3K14 and TNFAIP3 were the strongest. The mRNA levels of NF-κB， PTGS2， TNF-α， TRAF6， TRIF， ATF4， cxcl2 and IL-6 in E. coli group were significantly higher than those in E. coliΔHPI group （Plt;0.01）， and compared with E. coliΔHPI group， E. coli group significantly activated the expression of TNF/NF-κB pathway proteins. In addition， E. coli infection significantly increased the levels of NF-κB and IL-6 compared with the E. coliΔHPI group （Plt;0.01）. The results suggest that E.coli-HPI activates TNF/NF-κB pathway by synthesizing Ybt and binding to key proteins in TNF/NF-κB pathway.

Key words： Escherichia coli; high pathogenicity island; Yersiniobactin; analysis of evolution; TNF/NF-κB pathway

*Corresponding authors：" GAO Hong， E-mail： gaohongping@163.com; XIAO Peng，E-mail： aipengpengpiao@163.com

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）是引發(fā)人類食物中毒和動物疾病的重要食源性病原菌之一，對全球公共衛(wèi)生具有重要意義^［1］。該菌具有廣泛的感染范圍，可直接或間接在動物與人以及動物與動物之間相互傳播，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時也對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅^［2-3］。高致病性島（high pathogenicity island，HPI）是在耶爾森桿菌中發(fā)現(xiàn)的，其功能核心區(qū)是通過intb-irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-FyuA基因軸形成的，具有合成、調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運鐵載體-耶爾森桿菌素（Yersiniobactin，Ybt）的能力^［4-5］。盡管最初在耶爾森桿菌中首次報道HPI-Ybt，但在E. coli中也存在，其相似性達(dá)98%～100%^［6-7］。HPI僅存在于高毒力菌株中，對細(xì)菌的致病性起促進(jìn)作用，HPI通過合成Ybt與宿主細(xì)胞競爭鐵離子，促進(jìn)其增殖，進(jìn)而增強(qiáng)其致病力^［8-9］。多項研究表明，含有HPI的E. coli能激活宿主細(xì)胞的自噬性死亡和焦亡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)^［9-10］；并能夠上調(diào)豬小腸上皮細(xì)胞中TNF-α、IκB-α和IL-1的mRNA水平^［11］；然而，E. coli-Ybt對宿主細(xì)胞TNF/NF-κB信號通路的影響目前尚不清楚。

本研究分析了HPI節(jié)后基因intb的進(jìn)化趨勢，并基于生物信息學(xué)分析了E. coli感染細(xì)胞的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫，同時預(yù)測了Ybt與TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白的結(jié)合能力。隨后，利用qPCR、ELISA和Western blot進(jìn)一步探討了HPI-Ybt對TNF/NF-κB信號通路的影響，旨在為大腸桿菌的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和細(xì)菌

豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；E.coli由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理實驗室分離自腹瀉仔豬糞便，并驗證HPI結(jié)構(gòu)完整性^［12］。E.coli ΔHPI為實驗室前期利用CRISPR/Cas9技術(shù)所構(gòu)建^［13］。

1.1.2 主要試劑、儀器

RNAiso Plus（Trizol）、PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、TB Green Premix Ex Taq^TM（TaKaRa），IL-6、NF-κB ELISA檢測試劑盒（Ramp;D Systems），CFX熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Beckman低溫超速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司），核酸蛋白分析儀（德國IMPLEN公司），CO 2培養(yǎng)箱（美國Thermoscientific公司），酶標(biāo)儀（BioTek公司）。蛋白marker（翌圣生物科技），TNF-α Antibody、NF-κB-p65 Antibody、IKBα Antibody、IL-1βAntibody（Cell Signaling Technology）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)及大腸桿菌感染細(xì)胞

將IPEC-J2細(xì)胞復(fù)蘇后置于37℃、5% CO 2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞傳代至F3代后可用于后續(xù)試驗；挑取典型菌落在麥康凱平板上劃線培養(yǎng)，后接種于LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，待菌落活化后再接種于LB肉湯培養(yǎng)基，16 h后使用酶標(biāo)儀測OD 600 "nm值計算菌液濃度。

更換細(xì)胞培養(yǎng)孔中的陳舊培養(yǎng)液，按細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)之比為10∶1加入細(xì)菌，于感染后1、3、5和7 h進(jìn)行樣本收集。試驗分為3組：E. coli感染組、E. coliΔHPI感染組和空白對照組。

1.2.2 重分析大腸桿菌感染細(xì)胞的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫

大腸桿菌感染細(xì)胞的微陣列數(shù)據(jù)從基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫［GEO Accession viewer （nih.gov），GSE15636］下載^［14］。以MINiML文件形式下載原始數(shù)據(jù)，箱線圖通過boxplot進(jìn)行繪制，PCA圖通過R軟件包ggord進(jìn)行繪制。使用R軟件中的limma包研究差異表達(dá)的mRNA。在GEO中分析調(diào)整后的P值以糾正假陽性結(jié)果?！癆djusted P＜0.05且log 2Fold change＞1”被定義為差異顯著。R軟件包中的ClusterProfiler程序用于分析潛在mRNA的KEGG途徑，火山圖、熱圖通過R軟件包Pheatmap進(jìn)行展示^［15］。

1.2.3 分子對接

TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白的三維結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDBe-KB［PDBe-Knowledge Base （ebi.ac.uk）］；PTGS2：P35354、NFKBIA：P25963、BIRC3：Q13489、NFKB1：Q3V969、TNF：P01375、CXCL2：P19875、TNFAIP3：P21580、MAP3K14：Q99558、TRAF6：Q9Y4K3）^［16］，Ybt的三維結(jié)構(gòu)來源于PubChem CID （CID： 443589）。確定兩個分子的三維結(jié)構(gòu)后，使用CB-Dock2［CB-Dock2： An accurate protein-ligand blind docking tool （labshare.cn）］進(jìn)行分子對接^［17］，分子對接分?jǐn)?shù)小于-5視為可發(fā)生結(jié)合。

1.2.4 RT-qPCR檢測TLR4/NF-κB通路相關(guān)基因

參照RNAiso Plus（Trizol）說明書提取不同處理組細(xì)胞RNA；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6基因的mRNA水平。以內(nèi)參基因β-actin為參照，使用2^-ΔΔCt方法計算mRNA相對變化。引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，模板2 μL，上、下游引物（100 μmol·L^-1）各1 μL，RNase free water 6 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，32個循環(huán)。

1.2.5 ELISA檢測炎性因子的分泌

參照NF-κB和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書，檢測各組細(xì)胞上清中NF-κB和IL-6的蛋白含量。

1.2.6 Western blot檢測TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白

于6 h后收集不同處理的細(xì)胞，使用RAPI裂解液提取蛋白，并使用BCA法測定蛋白濃度。樣品進(jìn)行SDS-page凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，隨后將PVDF膜放Western blot封閉液封閉0.5 h，加入檢測對應(yīng)的一抗4 ℃過夜孵育，次日使用種屬對應(yīng)的二抗室溫下孵育2 h，進(jìn)行ECL顯色并采集圖像。

1.2.7 HPI結(jié)構(gòu)基因intb進(jìn)化分析

對實驗室分離保存的HPI陽性菌株用DNA提取試劑盒提取DNA為模板，使用intb引物（F： 5′-GCAGCACCTGAGTAACATAATGC-3′，R： 5′-ACGATATGCGACATTCGCATTTTG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為360 bp。PCR體系為2xPCR Mix10 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，水 6 μL，共20 μL。對擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用NCBI-BLAST功能進(jìn)行比對，之后下載相應(yīng)序列使用Mega6.0軟件繪制進(jìn)化樹并進(jìn)行序列比對。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用方差分析（ANOVA）或t檢驗分析組間差異，試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 HPI結(jié)構(gòu)基因intb的進(jìn)化分析

如圖1A所示，PCR擴(kuò)增得到360 bp的條帶，與設(shè)計的intb基因大小一致。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)本研究菌株YUNNAN001與GQ903040.1 Escherichia coli、GQ891729.1Citrobacterfreundii的遺傳關(guān)系較為接近，而與GQ903045.1 Escherichia coli的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1B），此外，序列對比發(fā)現(xiàn)，菌株YUNNAN001與其他菌株GQ891729.1、GQ891733.1、CBXE 010000231.1、FJ423188.2、BQGU01000230.1的變異度較低（圖1C）。

2.2 TNF/NF-κB通路參與大腸桿菌感染

如圖2A所示，對數(shù)據(jù)集GSE15636進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并對6個數(shù)據(jù)集進(jìn)行去批次處理（圖2B），2個組間無交集且重復(fù)性好。通過KEGG信號通路富集發(fā)現(xiàn)（圖2C），TNF通路和NF-κB通路均參與了大腸桿菌感染，并且TNF通路中有28個基因參與，NF-κB通路中有19個基因參與，其中有10個基因同屬于兩條通路（圖2D，圖3A）。通過火山圖和熱圖富集發(fā)現(xiàn)大腸桿菌感染顯著上調(diào)了TNF通路和NF-κB通路中共同的10個基因（PTGS2、NFKBIA、BIRC3、NFKB1、TNF、CXCL2、TNFAIP3、MAP3K14、TRAF、NFKB2）（圖3E，3B）。通過基因互作網(wǎng)絡(luò)分析和表達(dá)相關(guān)性分析構(gòu)建了TNF通路和NF-κB中上調(diào)的10個基因互作關(guān)系（圖1F），且這些基因的表達(dá)具有相關(guān)性（圖3C）。

2.3 分子對接預(yù)測Ybt與TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白的結(jié)合

使用分子對接軟件預(yù)測了Ybt與PTGS2、NFKBIA、BIRC3、NFKB1、TNF、CXCL2、TNFAIP3、MAP3K14、TRAF的相互作用，CB-Dock2預(yù)測Ybt與各分子的對接分?jǐn)?shù)，如表2所示，Ybt均能與TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白發(fā)生結(jié)合，其中與MAP3K14、TNFAIP3的結(jié)合最強(qiáng)，對接結(jié)果分?jǐn)?shù)分別為-8.2和-7.8；圖4顯示了Ybt與TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白結(jié)合的最優(yōu)對接結(jié)果。

2.4 RT-qPCR檢測

以β-actin基因為內(nèi)參基因，對E. coli、E. coliΔHPI菌株、空白對照組相應(yīng)時間點NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6轉(zhuǎn)錄水平測定，以2^-△△Ct法定量各組目的基因mRNA的水平。結(jié)果顯示（圖5），試驗組NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6轉(zhuǎn)錄水平均顯著或極顯著高于對照組（Plt;0.05或Plt;0.01），NF-κB、PTGS2、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6整體呈升高趨勢，各時間段E.coli組均高于或顯著高于E.coliΔHPI組（Plt;0.05），其中TNF-α各時間段E.coli組均低于或顯著低于E.coliΔHPI組（Plt;0.05），并在3 h時達(dá)到峰值。

2.5 TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

以GAPDH蛋白為內(nèi)參蛋白，Western blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)TNF/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示：HPI促進(jìn)了TNF/NF-κB通路的激活，促進(jìn)了TNF-α、NF-κB-p65、IL-1β的表達(dá)，同時抑制了IKBα的表達(dá)（圖6）。

2.6 細(xì)胞IL-6和NF-κB含量ELISA檢測

經(jīng)ELISA試劑盒檢測E. coli、E. coliΔHPI菌株感染細(xì)胞1、3、5和7 h后IL-6和NF-κB含量，結(jié)果顯示（圖7），試驗組IL-6和NF-κB含量均高于或極顯著高于對照組（Plt;0.01），且E. coli組極顯著高于E. coliΔHPI組（Plt;0.01），整體呈升高趨勢，在5 h時達(dá)到峰值。

3 討 論

inbt-irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-FyuA基因軸是HPI發(fā)揮功能的核心調(diào)節(jié)部分，通過合成轉(zhuǎn)運Ybt來增強(qiáng)E. coli-HPI的致病性。本研究對云南豬源E.coli Inbt基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)與GQ903040.1 Escherichia coli、GQ891729.1Citrobacterfreundii的遺傳關(guān)系較為接近，而HPI可以通過水平轉(zhuǎn)移到其他菌株中^［6-7］，推測本研究分離株的HPI可能來源于同源的Escherichia coli或Citrobacterfreundii。

NF-κB/TNF通路是廣為人知的免疫應(yīng)答介質(zhì)，協(xié)調(diào)各種細(xì)胞過程來應(yīng)對感染和炎癥^［18］。在病原體感染情況下，特別是細(xì)菌感染，例如大腸桿菌。激活這一通路對于建立有效的防御至關(guān)重要，在大腸桿菌感染過程中，NF-κB通路起到協(xié)調(diào)宿主反應(yīng)的關(guān)鍵作用^［19］。Ybt是由HPI編碼的一種鐵載體，它能夠與宿主競爭鐵元素的攝取，從而提高細(xì)菌在宿主內(nèi)的存活率，并增強(qiáng)細(xì)菌的致病性^［20-21］。先前的研究已經(jīng)顯示，產(chǎn)Ybt的大腸桿菌在腸道內(nèi)的黏附、侵襲和定植增加。此外，它還可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路來促進(jìn)大腸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬^［10］，并且攜帶HPI的大腸桿菌還能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，促進(jìn)IL-18和IL-1β的釋放^［9］；此外，E. coli-HPI感染會上調(diào)豬腸上皮細(xì)胞中TNF-α和IL-1的水平，從而加劇炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損害了宿主^［11］。NF-κB通路是由各種細(xì)胞外刺激啟動的，其中包括促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子，TNF與其受體結(jié)合后，會觸發(fā)一系列事件，最終導(dǎo)致NF-κB通路的激活^［22］，活化的NF-κB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)許多參與免疫和炎癥反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄^［23］。差異基因富集分析結(jié)果表明，大腸桿菌感染后，TNF通路和NF-κB通路中的10個共同基因（PTGS2、NFKBIA、BIRC3、NFKB1、TNF、CXCL2、TNFAIP3、MAP3K14、TRAF、NFKB2）顯著上調(diào)，推測該通路在產(chǎn)Ybt的大腸桿菌引起的感染中也發(fā)揮作用。為深入研究Ybt與TLR4/NF-κB通路之間的關(guān)系，本研究采用分子對接技術(shù)預(yù)測了Ybt與NF-κB/TNF信號通路相關(guān)蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，Ybt能夠與TNF/NF-κB通路中的蛋白發(fā)生結(jié)合，尤其是與MAP3K14和TNFAIP3的結(jié)合最為強(qiáng)烈，這種結(jié)合可能是Ybt促進(jìn)NF-κB/TNF信號通路激活的機(jī)制，然而這種結(jié)合需要進(jìn)一步的運用表面等離子體共振（surface plasmon resonance， SPR）等技術(shù)進(jìn)行驗證，來確保結(jié)果的可信度。

本研究采用E. coli體外感染IPEC-J2細(xì)胞模型，研究了E. coliHPI對TNF/NF-κB信號通路的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌HPI顯著提高了NF-κB/TNF信號通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，而感染產(chǎn)HPI缺陷的E. coliΔHPI則顯著降低了這些基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，提示，E. coliHPI激活了TNF/NF-κB信號通路，通過此炎性通路損傷機(jī)體。在大腸桿菌感染過程中，NF-κB的激活會導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽的生成，這些分子在招募免疫細(xì)胞前往感染部位、增強(qiáng)吞噬作用和引發(fā)炎癥反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用。為了驗證這一點，本研究檢測了大腸桿菌感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和NF-κB的水平，結(jié)果顯示，大腸桿菌感染后，IL-6和NF-κB水平顯著升高，而感染HPI缺陷的E.coliΔHPI后，IL-6和NF-κB水平顯著降低，這與Liu等^［11］的結(jié)果相類似。

4 結(jié) 論

TNF/NF-κB通路在大腸桿菌HPI致病機(jī)制中扮演的關(guān)鍵角色，其機(jī)制可能是Ybt結(jié)合TNF/NF-κB通路中的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而激活I(lǐng)PEC-J2細(xì)胞的TNF/NF-κB通路。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ LEE H， YOON Y. Etiological agents implicated in foodborne illness world wide［J］. Food Sci Anim Resour， 202 41（1）：1-7.

［2］ COIPAN C E， FRIESEMA I H， VAN DEN BELD M J C， et al. Sporadic occurrence of enteroaggregative shiga toxin-producing Escherichia coli O104：H4 similar to 2011 outbreak strain［J］. Emerg Infect Dis， 2022， 28（9）：1890-1894.

［3］ PAKBIN B， ALLAHYARI S， AMANI Z， et al. Prevalence， phylogroups and antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolates from food products［J］. Antibiotics （Basel）， 202 10（11）：1291.

［4］ HACKER J， BLUM-OEHLER G， MHLDORFER I， et al. Pathogenicity islands of virulent bacteria： structure， function and impact on microbial evolution［J］. Mol Microbiol， 1997， 23（6）：1089-1097.

［5］ CARNIEL E， GUILVOUT I， PRENTICE M. Characterization of a large chromosomal \"high-pathogenicity island\" in biotype 1B Yersinia enterocolitica［J］. J Bacteriol， 1996， 178（23）：6743-6751.

［6］ SCHUBERT S， RAKIN A， KARCH H， et al. Prevalence of the \"high-pathogenicity island\" of Yersinia species among Escherichia coli strains that are pathogenic to humans［J］. Infect Immun， 1998， 66（2）：480-485.

［7］ SHAN C L， MIAO S S， LIU C Y， et al. Induction of macrophage pyroptosis-related factors by pathogenic E. coli high pathogenicity island （HPI） in Yunnan Saba pigs［J］. BMC Vet Res， 202 17（1）：114.

［8］ MARTIN P， TRONNET S， GARCIE C， et al. Interplay between siderophores and colibactin genotoxin in Escherichia coli［J］. IUBMB Life， 2017， 69（6）：435-441.

［9］ WANG H， SHAN C L， GAO B， et al. Yersiniabactin-Producing E. coli induces the pyroptosis of intestinal epithelial cells via the NLRP3 pathway and promotes gut inflammation［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（14）：11451.

［10］ ZHAO W W， GAO B， LIU C， et al. High pathogenicity island is associated with enhanced autophagy in pathogenic Escherichia coli HPI-infected macrophages［J］. Res Vet Sci， 202 135：113-120.

［11］ LIU C Y， SHAN C L， DONG Q， et al. Pathogenic E. coli HPI upregulate the expression of inflammatory factors in porcine small intestinal epithelial cells by ubiquitin proteasome pathway［J］. Res Vet Sci， 2018， 120：41-46.

［12］ ZHANG B， ZHAO W W， GAO B， et al. Whole genome sequencing and biological characteristics of two strains of porcine Escherichia coli isolated from Saba pigs［J］. Curr Microbiol， 2022， 79（6）：182.

［13］ ZHANG B， WANG H D， ZHAO W W， et al. New insights into the construction of wild-type Saba pig-derived Escherichia coli irp2 gene deletion strains［J］. 3 Biotech， 202 11（9）：408.

［14］ PUTAALA H， BARRANGOU R， LEYER G J， et al. Analysis of the human intestinal epithelial cell transcriptional response to Lactobacillus acidophilus， Lactobacillus salivarius， Bifidobacterium lactis and Escherichia coli［J］. Benef Microbes， 2010， 1（3）：283-295.

［15］ YU G C， WANG LG， HAN Y Y， et al. ClusterProfiler： an R package for comparing biological themes among gene clusters［J］. OMICS， 2012， 16（5）：284-287.

［16］ PDBe-KB Consortium. PDBe-KB： collaboratively defining the biological context of structural data［J］. Nucleic Acids Res， 2022， 50（D1）：D534-D542.

［17］ GE E J， BUSH A I， CASINI A， et al. Connecting copper and cancer： from transition metal signalling to metalloplasia［J］. Nat Rev Cancer， 2022， 22（2）：102-113.

［18］ 劉淑娟， 李 亞， 范正媛， 等. 泊馬度胺通過抑制TNF-α/NF-κB信號通路改善COPD大鼠氣道炎癥及黏液高分泌［J/OL］. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2023. （2024-05-20）. http：//kns. cnki. net/kcms/detail/11. 1056. R. 20230619. 1056. 002. html.

LIU S J， LI Y， FAN Z Y， et al. Pomalidomide improves airway inflammation and mucus hypersecretion in COPD rats by inhibiting TNF-α/NF-κB signaling pathway［J/OL］. Medical Journal of Chinese People’s Liberation Army， 2023. （2024-05-20）. http：//kns. cnki. net/kcms/detail/11. 1056. R. 20230619. 1056. 002. html. （in Chinese）

［19］ WANG J， YANG J J， XIA W H， et al. Escherichia coli enhances Th17/Treg imbalance via TLR4/NF-κB signaling pathway in oral lichen planus［J］. Int Immunopharmacol， 2023， 119：110175.

［20］ DALMASSO G， NGUYEN H T T， FAS T， et al. Yersiniabactin siderophore of crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli is involved in autophagy activation in host cells［J］. Int J Mol Sci， 202 22（7）：3512.

［21］ GERNER R R， HOSSAIN S， SARGUN A， et al. Siderophore immunization restricted colonization of adherent-invasive Escherichia coli and ameliorated experimental colitis［J］. mBio， 2022， 13（5）：e0218422.

［22］ SUN S C. The non-canonical NF-κB pathway in immunity and inflammation［J］. Nat Rev Immunol， 2017， 17（9）：545-558.

［23］ FUSELLA F， SECL L， CANNATA C， et al. The one thousand and one chaperones of the NF-κB pathway［J］. Cell Mol Life Sci， 2020， 77（12）：2275-2288.

（編輯 白永平）