蒙古牛皮膚Qa-1b/NKG2A的表達(dá)及Qa-1b納米抗體的制備和功能鑒定

摘 要： 本研究旨在通過(guò)檢測(cè)蒙古牛皮膚Qa-1b/NKG2A的表達(dá)特征，分析其參與皮膚免疫的功能，及Qa-1b在抗黑素瘤發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)方法以及免疫共沉淀法對(duì)Qa-1b/NKG2A在皮膚中的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量和定位以及互作關(guān)系分析；以Qa-1b多肽為抗原，使用噬菌體展示技術(shù)，從羊駝黑色素瘤細(xì)胞納米抗體文庫(kù)中進(jìn)行淘篩，獲得結(jié)合性較強(qiáng)的納米抗體（Qa-1b-VHH）序列；構(gòu)建pET28a-Qa-1b-VHH原核表達(dá)重組質(zhì)粒，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和鎳柱純化，獲得Qa-1b納米抗體。經(jīng)ELISA檢測(cè)Qa-1b納米抗體與抗原的特異性后，將Qa-1b納米抗體應(yīng)用于Western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織中Qa-1b的表達(dá)，以及添加到B16黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過(guò)CCK8法、細(xì)胞劃痕法和Western blot法檢測(cè)其對(duì)B16細(xì)胞增殖及遷移的影響以及與增殖和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：Qa-1b和NKG2A在蒙古牛皮膚組織的毛囊外根鞘和血管內(nèi)皮中表達(dá)，在犢牛皮膚中的表達(dá)量顯著高于成年牛（Plt;0.01或Plt;0.001）。且Qa-1b和NKG2A在皮膚中存在互作關(guān)系。所獲得的Qa-1b納米抗體特異性較強(qiáng)，可用作Western blot和免疫組織化學(xué)中的一抗檢測(cè)其他組織中Qa-1b的表達(dá)；Qa-1b納米抗體添加到B16細(xì)胞培養(yǎng)基中，應(yīng)用CCK 8法和細(xì)胞劃痕法檢測(cè)該Qa-1b納米抗體對(duì)B16細(xì)胞增殖和遷移有明顯的抑制效果，細(xì)胞增殖過(guò)程中Ras、MEK1、CyclinD1、CDK4蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（Plt;0.01或Plt;0.001）。本試驗(yàn)揭示了Qa-1b/NKG2A參與皮膚免疫以保證毛囊正常生長(zhǎng)，尤其是犢牛；Qa-1b納米抗體可抑制B16細(xì)胞增殖和遷移，為增強(qiáng)皮膚免疫及抗黑素瘤發(fā)展的抗體藥物提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： Qa-1b；NKG2A；納米抗體；皮膚免疫；黑素瘤；B16細(xì)胞;蒙古牛

中圖分類號(hào)： S857.5"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0404-13

收稿日期：2024-02-26

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2022JBGS0023）；山西省自然科學(xué)基金（202203021222348）

作者簡(jiǎn)介：金聰俐（1994-），女，河南周口人，碩士生，主要從事羊駝納米抗體研究與應(yīng)用研究，E-mail：18339908802@163.com

*通信作者：范瑞文，主要從事羊駝毛色形成機(jī)理及羊駝納米抗體研究與應(yīng)用研究，E-mail： ruiwenfan@163.com；HERRID Muren，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： mherrid@gmail.com

The Expression of Qa-1b/NKG2A in the Skins of Mongolia Cattle and Preparation and

Functional Roles of the Qa-1b Nanobody

JIN" Congli JIA" Qiong REN" Hongrui CHI" Zhiduan BAI" Rui GUO" Xiang3， FAN" Ruiwen ""HERRID" Muren

（1.College of Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 03080 China;

2.Grassland amp; Cattle Investment Co.， Ltd， Hohhot 011500，" China;

3.Shanxi Bethune Hospital， Taiyuan 030000， China）

Abstract： To detect the expression of Qa-1b/NKG2A in skins of Mongolia cattle for analyzing the potential roles in skin immunity and inhibition of development of melanoma cells of Qa-1b. The expression of Qa-1b/NKG2A in skins was quantitatively analyzed by quantitative real-time PCR， Western blot and immunohistochemistry， and by co-immunoprecipitation for interaction between Qa-1b and NKG2A. The sequence of Qa-1b nanoloody （Qa-1b-VHH） binding with Qa-1b was obtained by phage display technique from alpaca melanoma cell nanobady library using Qa-1b polypeptide as antigen， followed by the construction of pET28a-Qa-1b-VHH prokaryotic expression recombinant plasmid and expression through IPTG inducing and purification through nickel column. After the binding of Qa-1b nanobody to antigen was detected by ELISA， the Qa-1b nanobody was used as the primary antibody in immunohistochemistry and Western blot methods to detect Qa-1b expression in tissues. Qa-1b nanobody was added into B16 cell culture medium， and its effects on the proliferation and migration of B16 cells and the expression of proteins related to proliferation and migration were detected by CCK8， cell scratch and Western blot methods， respectively. The results showed that Qa-1b and NKG2A were expressed in the out root sheath of hair follicles and vascular endothelium in Mongolian cattle skins with significantly higher expression in skins of young cattle than that in skins of the adult cattle （Plt;0.01 or Plt;0.001）. Moreover， there existed the interaction between Qa-1b and NKG2A. The Qa-1b nanobody with strong specificity was obtained， which could be used as a primary antibody for Western blot and immunohistochemistry to detect Qa-1b expression in other tissues. The supplement of Qa-1b nanobody in B16 culture medium resulted in the obvious inhibition of cell proliferation and migration， significant down-regulation of the expression of proteins such as Ras， MEK CyclinD and CDK4 during cell proliferation（Plt;0.01 or Plt;0.001）. The results suggested that Qa-1b might play a role in the skin immunity to ensure the normal growth of hair follicles， especially in calves，and the Qa-1b nanobody could inhibit the proliferation and migration of B16 cells， which provided a theoretical basis for the strengthened skin immunity and anti-melanoma antibody drugs.

Key words： Qa-1b; NKG2A; nanobody; skin immunity; melanoma; B16 cells; Mongolian cattle

*Corresponding authors： FAN Ruiwen， E-mail： ruiwenfan@163.com; HERRID Muren， E-mail：mherrid@gmail.com

人類白細(xì)胞抗原-E（HLA-E）基因是一類非典型的MHC-1b類分子，Qa-1b是HLA-E在小鼠中的同源蛋白，編碼基因位于17號(hào)染色體，相對(duì)分子質(zhì)量約為48 ku^［1］。Qa-1b分子僅在活化的造血細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和抗原活化的T細(xì)胞表面表達(dá)^［2］。Qa-1分子主要與Qdm肽（經(jīng)典MHCI類抗原信號(hào)肽）結(jié)合，同時(shí)還可與一些感染或炎癥相關(guān)的蛋白分子肽結(jié)合，Imani和Soloski^［3］證實(shí)牛分枝桿菌的65 ku熱休克蛋白（Hsp 65）的胰蛋白酶消化物，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面Qa-1b的穩(wěn)定表達(dá)，表明Qa-1b分子可能與熱休克蛋白衍生出來(lái)的肽結(jié)合。NKG2A是自然殺傷細(xì)胞受體2（NKG2）家族中的一員，相對(duì)分子質(zhì)量大約為43 ku，亦被稱作NK細(xì)胞凝集素樣受體C1（killer cell lectin-like receptor C KLRC1）^［4］，與CD94結(jié)合形成復(fù)合體，在多種免疫細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞、癌變組織侵襲的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞2型以及自然殺傷T細(xì)胞的表面，均可觀察到NKG2A/CD94的存在^［5］。Qa-1b分子可以與NKG2A/CD94或NKG2C/CD94結(jié)合成為復(fù)合體，抑制NK細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，在抗腫瘤免疫中具有重要的調(diào)控作用，是重要的“先天免疫檢查點(diǎn)”或“腫瘤微環(huán)境檢查點(diǎn)”^［6］。

哺乳動(dòng)物皮膚多發(fā)的黑色素瘤源于神經(jīng)脊黑素細(xì)胞，是一種具有侵襲性和致死性的皮膚癌，目前缺乏特效藥且預(yù)后差。納米抗體是一種僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，其直徑約2.5 nm，高約4 nm，相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H有15 ku^［7］。納米抗體具有抗原結(jié)合能力，與常規(guī)抗體的Y型結(jié)構(gòu)不同，其靠較長(zhǎng)的互補(bǔ)決定區(qū)形成的凸形結(jié)構(gòu)作為抗原結(jié)合位點(diǎn)^［8-9］，具有可穿透血腦屏障，強(qiáng)穩(wěn)定性、強(qiáng)抗原結(jié)合能力和強(qiáng)特異性等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于腫瘤等疾病的診斷和治療^［10-11］。本課題組前期已對(duì)NKG2A在小鼠黑素瘤細(xì)胞中的功能進(jìn)行了研究，并制備了具有抑制黑素瘤生長(zhǎng)和發(fā)展功能的NKG2A納米抗體^［12］。

哺乳動(dòng)物皮膚能防止體液流失、穩(wěn)定體溫和傳遞感覺(jué)輸入^［13-14］，其免疫微環(huán)境在維持組織穩(wěn)態(tài)、防御和修復(fù)過(guò)程中起主要作用。蒙古牛原產(chǎn)于蒙古高原地區(qū)，是內(nèi)蒙古自治區(qū)境內(nèi)主要的地方品種，因長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇而形成了抗寒、抗旱、抗病和耐粗飼等特點(diǎn)，適應(yīng)性極強(qiáng)^［15］，是我國(guó)最為古老的牛品種，其品質(zhì)優(yōu)、商品性好^［16］。其中，皮膚免疫在其抗寒和抗病能力中起重要作用^［17］。關(guān)于Qa-1b/NKG2A在皮膚免疫中的作用鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)基于Qa-1b與NKG2A/CD94復(fù)合物結(jié)合后，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，因此通過(guò)二者基因表達(dá)、互作分析以揭示Qa-1b和NKG2A在蒙古牛皮膚免疫過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。抑制Qa-1b的表達(dá)將發(fā)揮抗腫瘤功能，結(jié)合納米抗體的優(yōu)勢(shì)，篩選和制備Qa-1b納米抗體，為其應(yīng)用于皮膚免疫以及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制等方面提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

羊駝源黑色素瘤單域抗體噬菌體文庫(kù)、大腸桿菌TG1、B16細(xì)胞、輔助噬菌體M13K07、NKG2A納米抗體、pET28a載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。鼠源HLA-E抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源NKG2A抗體、Qa-1b多肽購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA回收試劑盒、HRP偶聯(lián)抗His標(biāo)簽抗體、2×Es Taq Maste Mix均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、TMB單組份顯色液、ELISA終止液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)記物（marker）購(gòu)自賽默飛世爾科技；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鎳柱購(gòu)自Cytiva；蒙古牛皮膚取自內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟阿左旗；犬黑色素瘤組織由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 Qa-1b/NKG2A在蒙古牛皮膚中的表達(dá)

1.2.1 皮膚總蛋白及RNA的提取

取約1 cm3皮膚組織研磨后平均分為兩份，一份加入1 mL蛋白裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100），冰上靜置30 min，離心后取上清，備用；另一份加入1 mL Trizol，加入200 μL氯仿，混勻后置于冰上靜置3 min，離心取水相后加入500 μL異丙醇，冰上靜置10 min，離心棄上清，加入500 μL 75%的冰乙醇，輕彈管底以清洗沉淀，離心棄上清，置于濾紙上干燥，加DEPC水，溶解沉淀，測(cè)定RNA濃度和純度。

1.2.2 Western blot" 將皮膚總蛋白上清與上樣緩沖液1∶4混合均勻，沸水加熱變性10 min，先80 V恒壓，待蛋白分離至5%濃縮膠外后，120 V恒壓，蛋白經(jīng)10%分離膠徹底分離后，200 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5%MPBS室溫封閉1 h，使用HLA-E抗體及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的NKG2A納米抗體作為一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，次日室溫復(fù)溫30 min，用goat anti-mouse IgG/HRP抗His-Tag抗體（1∶25 000）作為二抗，37 ℃孵育1 h，cECL法顯色、曝光。

1.2.3 熒光定量PCR（qPCR）

將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，建立10 μL的反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 5 μL，上下游引物（表1）各0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH 2O補(bǔ)齊至10 μL；該反應(yīng)體系用于熒光定量PCR反應(yīng)，其條件為預(yù)變性95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 5 s，退火59.5 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-Actin為內(nèi)參基因。

1.2.4 免疫共沉淀檢測(cè)Qa-1b/NKG2A在皮膚中的互作

取5只蒙古牛的皮膚總蛋白，每只100 ng，混合后，用蛋白裂解液稀釋到120 μL，分別加入10 μL的商業(yè)化兔來(lái)源NKG2A抗體、鼠來(lái)源HLA-E抗體和同源IgG，4 ℃過(guò)夜；次日在磁珠內(nèi)加入蛋白裂解液，離心棄上清，取磁珠20 μL，加入蛋白和一抗的復(fù)合物中，4 ℃孵育3 h，離心收集磁珠和上清，用PBS洗滌磁珠，最后一次用蛋白裂解液洗滌，在磁珠和上清中加入5×SDS-PAGE Loading Buffer變性，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.3 Qa-1b-VHH的篩選

1.3.1 噬菌體展示技術(shù)篩選Qa-1b特異性重組噬菌體

用Qa-1b多肽包被免疫管，濃度為20 μg·mL^- 體積為2 mL，4 ℃過(guò)夜；按實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行淘篩，第二、三、四輪淘篩的包被蛋白濃度分別改為10、5、5 μg·L^{-1 ［18］}。

1.3.2 單克隆抗體上清的制備

從第四輪淘篩的菌板上，挑取96個(gè)單克隆菌落置于有2 YTAG培養(yǎng)基的96深孔板中，30 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，取20 μL轉(zhuǎn)接到180 μL 2 YTAG，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入M13KO7輔助噬菌體感染后，30 ℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，離心深孔板20 min，取250 μL上清與250 μL 3%BSA溶液孵育1 h，用于間接ELISA檢測(cè)。

1.3.3 間接ELISA篩選陽(yáng)性菌株

將Qa-1b多肽以2 μg·mL^-1、50 μL·孔^- 包被于96孔酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜。次日，棄液體，加3%MPBS溶液，37 ℃封閉1 h，PBST洗板10次，加入BSA孵育過(guò)的上清100 μL·孔^- 對(duì)照組加入PBS 100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板，加入100 μL HRP-M13抗體（稀釋度為1∶20 000），37 ℃孵育1 h，洗板，加入顯色液，避光反應(yīng)5 min，加入終止液，在酶標(biāo)儀中測(cè)OD 450 nm處的吸收值，將陽(yáng)性菌株送到生工生物工程有限公司測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得陽(yáng)性菌株Qa-1b-VHH。

1.4 Qa-1b納米抗體的表達(dá)與純化

1.4.1 pET28a-Qa-1b-VHH原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序正確的Qa-1b-VHH序列，用primer5軟件設(shè)計(jì)引物，在引物的兩端各設(shè)計(jì)保護(hù)性堿基及酶切位點(diǎn)BamHⅠ和EcoRⅠ，Qa-1bF：ATAGGATCCCTCGTGGAGTCGGGGGGAG；Qa-1bR：TAAGAATTCTGGAGCTGGGGTCTTCGC。將陽(yáng)性菌株接入LB+Amp液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日提質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定，回收400～500 bp DNA片段，用T4連接酶將目的片段與BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的pET28a載體（His標(biāo)簽）連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序后與第一次的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，序列比對(duì)正確的菌株，進(jìn)行抗體的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4.2 Qa-1b納米抗體誘導(dǎo)表達(dá)及純化

取轉(zhuǎn)化的BL21菌液接到 LB-Amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min^-1過(guò)夜培養(yǎng)，次日按5 mL·管^-1分裝，在每管中加入濃度梯度為0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1的IPTG，16 ℃，110 r·min^-1振蕩培養(yǎng)20 h，離心棄上清，用700 μL PBS重懸沉淀，進(jìn)行超聲破碎，60 w，超聲2 s，間歇5 s，共2 min，離心取上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)，對(duì)比最佳誘導(dǎo)條件，并進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)表達(dá)的上清進(jìn)行鎳柱純化，使用不同濃度的咪唑梯度進(jìn)行洗脫，對(duì)各個(gè)梯度洗脫的產(chǎn)物再次進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，選取最佳咪唑洗脫濃度。

1.5 Qa-1b納米抗體的功能鑒定

1.5.1 Qa-1b納米抗體結(jié)合力驗(yàn)證

將Qa-1b多肽包被于96孔酶標(biāo)板，濃度為2 μg·mL^- 4 ℃過(guò)夜。次日，3%MPBS封閉1 h，PBST洗板10次，將純化獲得的Qa-1b納米抗體稀釋成不同梯度，作為一抗，37 ℃孵育1 h，洗板，加入HRP偶聯(lián)抗His標(biāo)簽抗體（1∶20 000），37 ℃孵育1 h，洗板，加入顯色液，避光反應(yīng)5 min，加入終止液，在酶標(biāo)儀中測(cè)OD 450 nm處的吸收值。

1.5.2 Qa-1b納米抗體在檢測(cè)組織中Qa-1b蛋白的應(yīng)用

分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)犬黑色素瘤和皮膚組織中Qa-1b的表達(dá)。取黑色素瘤組織制作石蠟切片，用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高溫修復(fù)10 min，PBS洗，在組織上滴加15%的H 2O "65 ℃ 15 min以脫黑色素顆粒；加入3%BSA，37 ℃封閉1 h，PBS洗，加入Qa-1b納米抗體，于4 ℃過(guò)夜孵育，室溫復(fù)溫30 min，PBS洗，加HRP偶聯(lián)抗His標(biāo)簽抗體（1∶100）37 ℃孵育1 h，DAB顯色。Western blot參照“1.2.2”，Qa-1b納米抗體作為一抗，HRP偶聯(lián)抗His標(biāo)簽抗體作為二抗。

1.5.3 Qa-1b納米抗體對(duì)B16細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用

將B16細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，消化離心重新接種于96孔板內(nèi)（2 000·孔^-1），待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度（0、80、120 μg·mL^-1）Qa-1b納米抗體，并分別在0、6、12、24、48 h時(shí)添加CCK8，10 μL·孔^- 共同孵育2 h后，在OD 450 "nm處測(cè)定吸光值；B16細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，棄去原培養(yǎng)基，用槍頭在孔內(nèi)劃線，PBS洗2次，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Qa-1b納米抗體（基礎(chǔ)濃度120 μg·mL^-1），并設(shè)置PBS對(duì)照組，在0、12、24、48 h觀察細(xì)胞遷移情況。

1.5.4 Qa-1b納米抗體對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

使用CCK-8法檢測(cè)到的抑制細(xì)胞增殖的條件，提取細(xì)胞總蛋白及RNA，應(yīng)用Western blot和qPCR技術(shù)，方法參照（“1.2.1”和“1.2.2”）檢測(cè)Ras、MEK1、CyclinD1、CDK4的蛋白及mRNA表達(dá)量（以β-Actin為內(nèi)參基因）。

2 結(jié) 果

2.1 Qa-1b/NKG2A在蒙古牛皮膚中的表達(dá)

2.1.1 qPCR檢測(cè)Qa-1b/NKG2A mRNA在皮膚中表達(dá)的相對(duì)定量

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)不同年齡蒙古牛皮膚中的Qa-1b/NKG2A基因表達(dá)相對(duì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Qa-1b/NKG2A mRNA在皮膚中表達(dá)，且在犢牛皮膚中的表達(dá)量顯著高于成年牛（Plt;0.01或Plt;0.001）（圖1A、圖2A）。

2.1.2 Western blot檢測(cè)Qa-1b/NKG2A蛋白質(zhì)在皮膚中表達(dá)的相對(duì)定量

為了驗(yàn)證Qa-1b及NKG2A蛋白質(zhì)是否在皮膚中表達(dá)，用Western blot方法檢測(cè)皮膚總蛋白中Qa-1b/NKG2A的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，皮膚蛋白中能檢測(cè)到Qa-1b/NKG2A的表達(dá)，且在犢牛皮膚中的表達(dá)量顯著高于成年牛（Plt;0.01或Plt;0.001）（圖1B、圖2B）。

2.1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Qa-1b/NKG2A在皮膚中的定位

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在皮膚的毛囊外根鞘中有強(qiáng)的Qa-1b/NKG2A陽(yáng)性信號(hào)，此外，在皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞中也可見其陽(yáng)性信號(hào)，結(jié)果說(shuō)明Qa-1b/NKG2A在皮膚中表達(dá)。通過(guò)對(duì)Qa-1b/NKG2A在皮膚中的表達(dá)情況，結(jié)果提示Qa-1b/NKG2A可能參與皮膚免疫過(guò)程，以維持皮膚正常的生理功能（圖1D、圖2D）。

2.1.4 Qa-1b/NKG2A在皮膚中的互作

經(jīng)免疫共沉淀法檢測(cè)皮膚中是否存在Qa-1b/NKG2A互作關(guān)系，結(jié)果顯示，與同源IgG抗體相比，用預(yù)先固化在瓊脂糖珠上的Qa-1b抗體免疫沉淀Qa-1b蛋白后，Western blot法可檢測(cè)到與Qa-1b結(jié)合的NKG2A蛋白（圖3A）；相反，用預(yù)先固化在瓊脂糖珠上的NKG2A抗體免疫沉淀NKG2A蛋白后，Western blot法可檢測(cè)到與NKG2A結(jié)合的Qa-1b蛋白（圖3B）。

2.2 Qa-1b納米抗體的制備

使用噬菌體展示技術(shù)，在已構(gòu)建好的羊駝B16噬菌體文庫(kù)菌中，用Qa-1b多肽進(jìn)行4輪淘篩后，應(yīng)用間接ELISA篩選陽(yáng)性菌落（表2），經(jīng)測(cè)序，選擇陽(yáng)性最強(qiáng)的菌落（Qa-1b-VHH-A-6）進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

將比對(duì)正確的Qa-1b納米抗體序列翻譯成氨基酸，與納米抗體的結(jié)構(gòu)序列分析，Qa-1b-VHH-A-6序列中有142個(gè)氨基酸，CDR3區(qū)有16個(gè)氨基酸"" （圖4）。

將pET28a與Qa-1b-VHH-A-6雙酶切后（圖5），用T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序正確后，即為構(gòu)建的pET28a-Qa-1b-VHH重組質(zhì)粒（圖6）。在菌液中加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后離心取上清，用Western blot檢測(cè)，在誘導(dǎo)表達(dá)條件16 ℃、110 r·min^-1振蕩培養(yǎng)20 h，加入IPTG濃度為0.6 mmol·L^-1時(shí)，上清中的表達(dá)量最高（圖7）。

用0.6 mmol·L^-1濃度IPTG將重組質(zhì)粒進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，用不同濃度的咪唑洗脫，使用Western blot檢測(cè)，在洗脫咪唑濃度為30%時(shí)，可洗脫到大小約15 ku且條帶較為單一的納米抗體（圖8）。

2.3 Qa-1b納米抗體的功能

2.3.1 Qa-1b納米抗體結(jié)合力

應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)Qa-1b納米抗體與Qa-1b的結(jié)合力，在抗體稀釋度為1∶32時(shí)抗體仍有結(jié)合作用（表3）。

2.3.2 Qa-1b納米抗體用于檢測(cè)Qa-1b在黑素瘤和皮膚中的表達(dá)

用Qa-1b納米抗體作為免疫組織化學(xué)法一抗，在犬黑色素瘤組織中檢測(cè)Qa-1b表達(dá)分布（圖9）。用Qa-1b納米抗體作為Western blot中的一抗，檢測(cè)皮膚蛋白中Qa-1b的表達(dá)，在犢牛皮膚組織中的檢測(cè)較為靈敏（圖10）。

2.3.3 Qa-1b納米抗體對(duì)B16細(xì)胞增殖和遷移的影響

將純化后的Qa-1b納米抗體使用脫鹽柱脫鹽后，應(yīng)用CCK8試驗(yàn)，檢測(cè)Qa-1b納米抗體對(duì)B16細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，在加入Qa-1b抗體濃度為120 μg·mL^-1時(shí)有明顯的抑制作用。應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，將抗體濃度用去血清培養(yǎng)基稀釋至120 μg·mL^- 每隔12 h，觀察細(xì)胞的遷移狀態(tài)，在培養(yǎng)24 h后，呈現(xiàn)明顯的抑制細(xì)胞遷移作用（圖11A、11B）。

Qa-1b納米抗體作用于B16后，通過(guò)qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)MEK1、CDK4、Ras、CyclinD1 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.001）（圖11C）；經(jīng)Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白MEK1、CDK4、Ras、CyclinD1表達(dá)量顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）（圖11D、11E）。

3 討 論

哺乳動(dòng)物皮膚的免疫微環(huán)境在維持組織穩(wěn)態(tài)、防御和修復(fù)過(guò)程中起重要的作用^［19］。在毛囊形態(tài)發(fā)生完成時(shí)，郎格漢斯細(xì)胞等免疫反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)入毛囊，分布到外根鞘中^［20］。本實(shí)驗(yàn)我們也發(fā)現(xiàn)Qa-1b和NKG2A在毛囊外根鞘中表達(dá)，二者存在互作關(guān)系，結(jié)果提示Qa-1b/NKG2A參與毛囊免疫系統(tǒng)，保證毛囊正常生長(zhǎng)。此外，二者在幼齡皮膚中的表達(dá)量高于成年皮膚中的表達(dá)，一方面與毛囊生長(zhǎng)周期有關(guān)，另一方面可能與蒙古牛的生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)，毛囊對(duì)皮膚具有一定的保護(hù)作用。此外，Qa-1b在巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)，且與感染或炎癥相關(guān)的蛋白分子肽結(jié)合，能應(yīng)用到皮膚感染或者炎癥免疫反應(yīng)中，NKG2A受體可通過(guò)與HLA-E分子結(jié)合，在免疫監(jiān)視過(guò)程中幫助免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除感染或突變的細(xì)胞，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)^［21］。因此，Qa-1b/NKG2A在皮膚中的作用不僅維持正常的皮膚功能，而且在皮膚病發(fā)生過(guò)程中通過(guò)參與皮膚免疫清除病原體。

在肉牛養(yǎng)殖過(guò)程中，皮膚病是最常見的一種疾病，影響牛的生長(zhǎng)性能和牛的皮張質(zhì)量，從而引起經(jīng)濟(jì)損失^［22］。黑色素瘤是一種哺乳動(dòng)物常見的皮膚惡性腫瘤，發(fā)病率、惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移^［23］。黑色素瘤在犬類動(dòng)物中尤其是純種犬的發(fā)病率較高，常見于口腔、皮膚、眼部和腳趾部^［24］，除此之外大多數(shù)家養(yǎng)動(dòng)物犬、貓、馬以及野生動(dòng)物和海洋動(dòng)物也會(huì)發(fā)生。雖然沒(méi)有蒙古牛黑素瘤發(fā)生的報(bào)道，但在乳牛^［25］、水牛^［26］和黃牛^［27］中均有過(guò)黑素瘤發(fā)生的報(bào)道。為了研究Qa-1b在黑素瘤發(fā)展過(guò)程中的抑制作用，本試驗(yàn)制備Qa-1b納米抗體后，通過(guò)干擾其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)細(xì)胞中的Ras、MEK1、CyclinD1、CDK4基因表達(dá)量均被下調(diào)。

RAS GTP酶可以激活生長(zhǎng)因子受體，聯(lián)系下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且三種RAS亞型（HRAS、KRAS和NRAS）共同代表了人類惡性腫瘤中最常見的突變癌基因^［28-29］。在15%～30%的黑色素瘤樣本中鑒定出NRAS突變，并被認(rèn)為是這些患者最重要的致癌因素^［30］。Raf-1可以通過(guò)磷酸化激活MEK-1激酶，而MEK-1可以激活ERK即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，其可以級(jí)聯(lián)控制不同細(xì)胞類型的增殖和分化^［31-32］。突變的c-Kit可以刺激Ras-Raf-Mek-Erk通路和黑素細(xì)胞增殖^［33］。本項(xiàng)目組前期的試驗(yàn)結(jié)果表明^［12］，在一種人黑色素瘤A375細(xì)胞中敲減HLA-E基因，A375細(xì)胞的增殖和遷移均受到抑制，且信號(hào)通路上的基因HLA-E、Ras、Raf、CyclinD1、CDK4的蛋白含量和相對(duì)mRNA表達(dá)量低，同時(shí)也證實(shí)Qa-1b在小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中通過(guò)Ras-Raf-MAPK信號(hào)通路影響腫瘤生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。

本試驗(yàn)獲得的Qa-1b納米抗體具有一定的結(jié)合性，即Qa-1b納米抗體可以檢測(cè)到犬黑色素瘤組織和皮膚組織中Qa-1b蛋白的分布，可能是因?yàn)镃DR3區(qū)具有16個(gè)氨基酸，與正常人和小鼠的重鏈可變區(qū)CDR3區(qū)約含9～12個(gè)氨基酸^［34］相比，較長(zhǎng)的CDR3區(qū)彌補(bǔ)了常規(guī)抗體有6個(gè)重鏈可變區(qū)而納米抗體僅有3個(gè)CDR區(qū)所帶來(lái)的結(jié)合能力不足的問(wèn)題，且較長(zhǎng)的CDR3區(qū)可形成一個(gè)突起的環(huán)區(qū)，使其可結(jié)合一些常規(guī)抗體無(wú)法結(jié)合的位點(diǎn)^［35］。因此，該納米抗體不僅可以應(yīng)用于與免疫相關(guān)的方法進(jìn)行抗原檢測(cè)，如ELISA、免疫熒光、免疫組化等技術(shù)，而且可用于抑制黑素瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的工具。

4 結(jié) 論

本研究驗(yàn)證了Qa-1b/NKG2A在蒙古牛皮膚中表達(dá)，參與皮膚免疫。所獲的Qa-1b納米抗體結(jié)合性較強(qiáng)，在細(xì)胞水平上可靶向抑制Qa-1b通過(guò)Ras-Raf-MAPK路徑發(fā)揮抗腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的功能，為增強(qiáng)皮膚免疫和抗黑素瘤發(fā)展的抗體藥物提供理論依據(jù)。

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（編輯 白永平）