表兒茶素沒食子酸酯對MAC-T和小鼠乳腺炎癥與細(xì)胞焦亡及NF-κB通路和NLRP3炎性小體的抑制效應(yīng)

摘 要： 本研究旨在探究表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate， ECG）對牛乳腺上皮細(xì)胞NF-κB（nuclear factor kappa B）炎性通路和NOD樣受體3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體的抑制作用。利用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理牛乳腺上皮細(xì)胞系（MAC-T）和小鼠乳腺；采用CCK-8法篩選ECG處理MAC-T細(xì)胞的最佳濃度，ELISA法檢測促炎因子、氧化應(yīng)激指示因子以及焦亡指示因子的表達(dá)水平；蘇木精-伊紅染色和Annexin V-FITC/PI法檢測小鼠乳腺組織炎性變化和細(xì)胞膜破裂情況；Western blot檢測NF-κB、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）、caspase-1和Gasdermin NH 3 端（GSDMD-N）的表達(dá)水平；免疫熒光檢測p65核轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）ECG在10、20、40 mg·kg^-1濃度下均可減輕LPS誘導(dǎo)的乳腺炎癥和炎性細(xì)胞浸潤；2）ECG在體內(nèi)和體外均可顯著且劑量依賴性地降低LPS誘導(dǎo)的促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和氧化應(yīng)激指示因子（COX-2、iNOS、MPO）表達(dá)水平（Plt;0.05）；3）ECG劑量依賴性地降低了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率以及ROS、IL-18和LDH焦亡指示因子表達(dá)水平（Plt;0.05）；4）ECG極顯著地抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3、ASC、GSDMD-N、caspase-1、磷酸化p65的表達(dá)與核轉(zhuǎn)移（Plt;0.05）。綜上表明，ECG抑制MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺炎癥與細(xì)胞焦亡以及NF-κB通路和NLRP3炎性小體。本研究為利用ECG替代抗生素防治牛乳腺炎提供了新的數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 表兒茶素沒食子酸酯；NF-κB；乳腺炎；NLRP3炎性小體；焦亡

中圖分類號： S857.26"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0430-12

收稿日期：2024-01-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32171673）

作者簡介：王浩磊（1999-），男，上海人，碩士生，主要從事動物營養(yǎng)與動物炎癥治療研究，E-mail： yipianche@qq.com；劉夢燕（1998-），女，山西汾陽人，碩士生，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail： 798163059@qq.com。王浩磊和劉夢燕為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：蔣曹德，主要從事動植物分子遺傳育種與飼料生物技術(shù)與加工利用研究，E-mail： jcdpjx@swu.edu.cn；林 濤，主要從事動物營養(yǎng)與動物炎癥治療研究，E-mail： 727826660@qq.com

Inhibition of Epicatechin Gallate on Inflammation and Pyroptosis as Well as NF-κB

Pathway and NLRP3 Inflammasome in MAC-T Cells and Mouse Mammary Glands

WANG" Haolei LIU" Mengyan LONG" Quan LI" Manman L Xiang LIN" Tao 為制約奶牛健康和乳品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素^［1］。乳腺炎主要由微生物感染引起，但是環(huán)境因素、人為因素以及牛自身的遺傳因素等也是其誘因^［1］。引起乳腺炎的主要的病原菌包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和鏈球菌（Streptococcus）等，其中大腸桿菌是導(dǎo)致急性臨床乳腺炎最常見的病原菌，它的細(xì)胞外膜主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）通過激活核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB）信號通路和NOD樣受體3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎性小體誘發(fā)乳腺組織炎性反應(yīng)和焦亡^［2］。因此，LPS被廣泛應(yīng)用于多種動物的炎癥模型的建立^［3-5］。

焦亡為依賴于caspase-1和促炎調(diào)節(jié)的細(xì)胞程序性壞死，又稱細(xì)胞炎性死亡^［6］。在LPS誘導(dǎo)的焦亡信號通路中，LPS被Toll樣受體4（TLR4）二聚體識別，導(dǎo)致NF-κB的活化與NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎性小體的組裝^［2］，進(jìn)而通過caspase-1、Gasdermin NH 3端 （GSDMD-N）的作用形成細(xì)胞膜穿孔，釋放乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）和IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子促進(jìn)炎性疾病的發(fā)生^［7-9］。因此，NF-κB和NLRP3炎癥小體在LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和細(xì)胞焦亡中起關(guān)鍵作用。

表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate， ECG）是一種重要的類黃酮物質(zhì)，廣泛存在于茶、葡萄、可可和紅酒中^［10-11］。眾多研究已證實(shí)ECG在抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗凋亡等方面具有顯著作用^［12-16］，因此它被用于齲齒、牙周病和動脈粥樣硬化的治療研究^［17-18］。在作用機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)ECG通過阻斷p65的磷酸化來抑制NF-κB的激活，減少NLRP3炎癥小體的形成和IL-1β與TNF-α的釋放，從而緩解小鼠在缺氧環(huán)境下的神經(jīng)炎癥^［13］。同時(shí)，ECG抑制絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路，減輕炎癥和細(xì)胞凋亡^［14］。最近的研究也表明，ECG抑制NF-κB和MAPK的磷酸化，防止小鼠動脈粥樣硬化的惡化^［18-19］。然而，目前關(guān)于ECG的報(bào)道大多局限于小鼠和大鼠模型的抗炎和抗凋亡特性，ECG在乳腺炎性反應(yīng)和焦亡方面的作用有待闡明。

本研究通過LPS刺激MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺，探討了ECG對乳腺炎癥與焦亡的抑制作用及其分子機(jī)制，為利用ECG替代抗生素防治乳腺炎奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

DMEM培養(yǎng)基（Gibco，蘇州）中加入100 U·mL^-1青霉素、10%胎牛血清和100 μg·mL^-1鏈霉素（Solarbio，北京）。根據(jù)需要選擇96孔板或者6孔板，將MAC-T細(xì)胞（BNCC，河北廊坊）接種于上述培養(yǎng)基，并在37℃、5% CO 2（Forma Series 3 WJ，Thermo）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。采用1 μg·mL^-1 LPS^［3-4］和1、15或30 μg·mL^-1 ECG處理MAC-T細(xì)胞（ECG的處理濃度根據(jù)下述細(xì)胞活性檢測確定），并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每個(gè)處理重復(fù)5次，用LPS單獨(dú)處理的細(xì)胞和LPS+20 μg·mL^-1 地塞米松（dexamethasone，DEX，一種廣泛用于治療炎癥性疾病的類固醇藥物）處理的細(xì)胞分別作為ECG處理陰性和陽性對照。

1.2 細(xì)胞活性檢測（CCK8）

將重懸的MAC-T細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100 μL的細(xì)胞懸液。待細(xì)胞長到90%（2×106細(xì)胞·孔^-1），將配制好的ECG原液用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至0、1、3、6、15、30、60、90、120和200 μg·mL^-1處理細(xì)胞，并在處理孔周圍加入100 μL PBS 緩沖液，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。處理24 h后在每孔加入10 μL CCK-8溶液（Solarbio，北京），培養(yǎng)箱孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度值（OD）。

1.3 動物體內(nèi)試驗(yàn)

從恩彼生物技術(shù)有限公司（重慶）購買6～8周齡的BALB/c小鼠（18只，♀36只），母鼠每籠2只，公鼠每籠1只，自由采食，在光照/黑暗各12 h的條件下飼養(yǎng)7 d。隨機(jī)選取2只母鼠和1只公鼠共同飼養(yǎng)在一個(gè)籠子里，進(jìn)行配種。產(chǎn)后7 d，將成活并泌乳的30只母鼠隨機(jī)分為6組，每組5只：空白對照組、LPS組（10 μg·kg^-1）、LPS+ECG（10、20和40 mg·kg^-1）組^［20］，以及LPS+DEX（0.5 mg·kg^-1）組，其中LPS組、LPS+DEX組分別作為ECG處理陰性和陽性對照。注射前將母鼠和子鼠分離2 h后，LPS+DEX和LPS+ECG組進(jìn)行腹腔注射，空白組和 LPS 組腹腔注射等量生理鹽水。按照前期的方法^［4］，1 h后用2%戊巴比妥鈉（50 mg·kg^-1）麻醉小鼠，將LPS注射到雌鼠的第四對乳頭的乳腺導(dǎo)管中。24 h后當(dāng)乳腺出現(xiàn)紅腫充血時(shí)眼球采血5 mL，注入含有0.1 mL肝素鈉（10 mg·mL^-1 鹽水溶液）的10 mL離心管中，4 ℃，3 000×g離心30 min，收集血清。頸部脫臼法處死小鼠，取出乳房組織，其中一部分置于4%多聚甲醛固定液中，另一部分儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)并按“1.1”方法處理，小鼠按“1.3”方法處理。根據(jù) ELISA試劑盒說明書（博諾恒生物科技有限公司，重慶）測定細(xì)胞上清和小鼠血清中炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和氧化應(yīng)激指示因子（COX-2、iNOS）的含量。

1.5 Western blot

將“1.1”和“1.3”中處理過的細(xì)胞和小鼠組織研磨，使用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（Solarbio，北京）提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio，北京）進(jìn)行定量。Western blot按照Ma等^［3］的方法，每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)。所用的一抗包括p65（bs-23217R）、p-p65（bs-0982R）、IκB（bs-1287R0）、p-IκB（bs-2513R）、NLRP3（19771-1-AP）、caspase-1（22915-1-AP）、ASC（10500-1-AP）、GSDMD-N（20770-1-AP）、β-actin（bsm-33036M）（Proteintech，湖北武漢），一抗稀釋比例均為1∶1 000；二抗為 Goat Anti-rabbit IgG/HRP（BS13278；Bioss，北京），稀釋比1∶5 000。膠條使用化學(xué)發(fā)光ECL-Western blot檢測試劑（Bioground，重慶）進(jìn)行可視化，并使用Image Lab（版本5.2. Bio-Rad）進(jìn)行定量。

1.6 免疫熒光

細(xì)胞和小鼠處理如“1.1”和“1.3”，按照前期的方法進(jìn)行GSDMD、NLRP3和p65核轉(zhuǎn)移免疫熒光檢測^［3-4］。簡而言之，處理過的MAC-T細(xì)胞相繼用乙醇孵育10 min，2%的Triton X-100（Beyotime， 重慶）孵育5 min，5%的BSA Block Buffer（Beyotime， 重慶）孵育1 h；分別利用GSDMD、NLRP3以及磷酸化p65（p-p65）的抗體孵育，再用兔抗山羊IgG/Cy3抗體（Bioss， 北京）孵育；使用DAPI對核進(jìn)行染色，在熒光倒置顯微鏡（Leica， Wetzlar， GER）下觀察。

1.7 Annexin V-FITC/PI分析

將“1.1”處理的MAC-T細(xì)胞接種于24孔板，待其生長到90%時(shí)，用PBS洗滌3次。按照Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒（翌圣生物科技，上海）說明書在每個(gè)培養(yǎng)孔加入10 μL Annexin V-FITC和20 μL PI Staining Solution，避光、室溫反應(yīng)10～15 min。再加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，1 h內(nèi)利用熒光倒置顯微鏡（Leica， Wetzlar， GER）進(jìn)行拍照，并使用Image Lab（版本5.2. Bio-Rad）進(jìn)行定量。

1.8 蘇木精-伊紅（HE）染色

HE染色由武漢賽維爾生物科技有限公司完成，即將“1.3”方法處理的小鼠R4乳腺組織固定在4%（體積比）的甲醛中，經(jīng)過脫水、透明化、蠟浸和石蠟包埋后切成5 μm厚的切片。切片進(jìn)行二甲苯脫蠟（共3缸，5 min·缸^-1）；過無水、90%、80%、70%的乙醇（各1缸，均3 min·缸^-1），蒸餾水再清洗3 min；依次進(jìn)行蘇木精染色10 min、伊紅染色5 min，經(jīng)80%、90%和無水乙醇脫水及二甲苯透明化處理后，在生物顯微鏡（Leica， Wetzlar， GER）下觀察組織損傷。

1.9 髓過氧化物酶、活性氧和乳酸脫氫酶檢測

收集“1.1”方法處理的細(xì)胞上清和“1.4”方法處理的小鼠血清，按照MPO、ROS檢測試劑盒和LDH活性檢測試劑盒（Solarbio， 北京）說明書，使用Multiskan GO（Thermo， 美國）分別于460、525和450 nm波長處測定MPO（myeloperoxidase）和LDH活性以及ROS（reactive oxygen species）的含量，每次檢測重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan多重比較。統(tǒng)計(jì)顯著性設(shè)定為Plt;0.05 或 Plt;0.01。

2 結(jié) 果

2.1 ECG在MAC-T細(xì)胞與小鼠乳腺中的抗炎作用

首先，利用不同濃度的ECG處理MAC-T細(xì)胞篩選最佳的處理濃度。CCK-8檢測表明，ECG在1、3、6、15和30 μg·mL^-1濃度下對MAC-T細(xì)胞活性無影響；當(dāng)ECG濃度在60 μg·mL^-1以上時(shí)顯著降低了細(xì)胞活性（Plt;0.0 圖1A）。因此，在后續(xù)研究中采用的ECG濃度梯度為1、15和30 μg·mL^-1。進(jìn)一步采用ELISA檢測不同濃度ECG處理下MAC-T細(xì)胞促炎細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激細(xì)胞因子的表達(dá)變化（圖1B～G）。與對照組相比，受LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的蛋白水平以及MPO活性極顯著增加（Plt;0.01）；但是，ECG處理后上述細(xì)胞因子的表達(dá)和MPO活性呈劑量依賴性且極顯著降低（Plt;0.01），其中30 μg·mL^-1 ECG處理組的MPO活性極顯著低于DEX處理組（Plt;0.01）。

其次，為了證實(shí)ECG體外抗炎效果，分析了ECG對小鼠乳腺炎癥的抑制作用。圖2A顯示，對照組小鼠乳腺組織正常，LPS組小鼠乳腺組織腫脹、充血明顯。HE染色顯示LPS刺激引起腺泡腔充血性水腫，白細(xì)胞浸潤；然而，DEX和ECG處理明顯減輕了LPS誘導(dǎo)的乳腺組織病理變化（圖2A、2B）。MPO檢測也證實(shí)，ECG處理可極顯著降低LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤（Plt;0.0 圖3A）。進(jìn)一步分析了ECG對小鼠乳腺組織中促炎細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激細(xì)胞因子表達(dá)的影響。與對照組相比，LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的蛋白水平極顯著增加（Plt;0.01）；但是，ECG處理后這些細(xì)胞因子的表達(dá)呈劑量依賴性而且極顯著降低（Plt;0.01），其中40 μg·kg^-1 ECG處理組的MPO活性和IL-1β、COX-2的表達(dá)極顯著低于DEX處理組（Plt;0.0 圖3B～F）。

2.2 ECG對NF-κB炎性通路的調(diào)控

采用Western blot檢測NF-κB兩個(gè)關(guān)鍵亞基（p65和IκB）的蛋白和磷酸化水平。在MAC-T細(xì)胞（圖4A～C），p65和IκB的蛋白水平在不同處理之間沒有顯著差異（Pgt;0.05）；LPS處理的細(xì)胞中p-p65和p-IκB 蛋白水平較對照組極顯著增加（Plt;0.01）；在ECG（1、15 和 30 μg·mL^-1）處理的細(xì)胞中，p-p65和p-IκB蛋白水平極顯著下降（Plt;0.01）。同樣，ECG（10、20、40 mg·mL^-1）極顯著降低小鼠乳腺組織中p-p65和p-IκB蛋白水平（Plt;0.0 圖4D～F）。在15和30 μg·mL^-1 ECG處理組的MAC-T細(xì)胞和20、40 mg·mL^-1 ECG處理的乳腺組織中，p-p65和p-IκB蛋白水平極顯著低于DEX處理組（Plt;0.01）。

采用免疫熒光分析了MAC-T細(xì)胞中p65的核移位（圖5A）。結(jié)果表明，LPS增強(qiáng)了細(xì)胞核p65的熒光信號，而ECG減弱了細(xì)胞核p65的信號。MAC-T細(xì)胞核p65含量分析也顯示，LPS處理導(dǎo)致核中p65水平極顯著高于對照組（Plt;0.01），ECG劑量依賴性地降低了細(xì)胞核p65含量（Plt;0.0 圖5B）。

2.3 ECG對MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺焦亡的抑制效應(yīng)

采用Annexin V-FITC/PI方法檢測各處理組細(xì)胞膜破裂情況。與空白對照組相比，LPS組被PI標(biāo)記的紅色細(xì)胞數(shù)目增多；但是ECG處理組的紅色細(xì)胞數(shù)目較LPS組明顯降低（圖6A）。熒光定量分析也表明，ECG各處理組細(xì)胞破裂程度均較LPS組極顯著地降低（Plt;0.01），且具有劑量依賴性（圖6B）。

其次，通過檢測細(xì)胞焦亡特異指標(biāo)ROS、LDH和IL-18的表達(dá)水平，以進(jìn)一步證明ECG對LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞焦亡的抑制作用。與空白對照組相比，LPS組MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺ROS熒光強(qiáng)度、LDH活性和IL-18水平極顯著增強(qiáng)（Plt;0.0 圖7）；但是，ECG處理劑量依賴性而且極顯著降低了ROS、LDH和IL-18的水平（Plt;0.01）。

2.4 ECG對LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體的影響

采用Western blot檢測NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與空白對照組相比，LPS 組MAC-T細(xì)胞中NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）、caspase-1和GSDMD-N的蛋白水平極顯著提高（Plt;0.0 圖8）；與 LPS處理相比，ECG劑量依賴性地降低上述蛋白的表達(dá)水平（Plt;0.01），而且30 μg·mL^-1 ECG處理組細(xì)胞中caspase-1、ASC和GSDMD-N表達(dá)量極顯著低于DEX處理組（Plt;0.01）。同樣，ECG處理劑量依賴性地降低了小鼠乳腺組織中LPS誘導(dǎo)的上述蛋白的表達(dá)水平，且caspase-1、ASC和GSDMD-N表達(dá)量極顯著低于DEX處理組（Plt;0.0 圖9）。

3 討 論

作者和其他前期研究報(bào)道，1 μg·mL^-1 LPS通過NF-κB和MAPK通路觸發(fā)MAC-T細(xì)胞的炎性反應(yīng)^［3-4］，并且通過NLRP3焦亡小體抑制細(xì)胞焦亡反應(yīng)^［7］。另一方面，DEX是一種廣泛用于治療各種急性和慢性炎癥性疾病的藥物，該藥物對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用已在小鼠等動物模型中得到廣泛的證實(shí)^{［3，21］}。本研究發(fā)現(xiàn)，ECG在≤30 μg·mL^-1的濃度下對MAC-T細(xì)胞活性沒有影響，表明對細(xì)胞無毒性（圖1A）?；谏鲜鲞@些數(shù)據(jù)，并且Esmaeelpanah等^［22］發(fā)現(xiàn)10、20和30 mg·kg^-1ECG對丙烯酰胺引起的大鼠神經(jīng)毒性具有抑制效應(yīng)，本研究利用LPS刺激MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺，并且設(shè)計(jì)空白對照組、LPS組、LPS + DEX組和LPS + ECG組。通過比較LPS組與空白對照組以揭示LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，再通過LPS + ECG組與LPS + DEX組、LPS組的比較反映ECG的效應(yīng)。

很多研究報(bào)道炎性因子在乳腺炎發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用^［3-5］。ECG為兒茶素多酚成分之一，兒茶素多酚還包括表兒茶素（epicatechin， EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin， EGC）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG）^［23］。兒茶素的結(jié)構(gòu)為黃烷-3-醇，由兩個(gè)苯環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）通過一個(gè)二氫吡喃雜環(huán)（C環(huán)）相連而成，形成C 6-C 3-C 6的結(jié)構(gòu)通式；ECG、EC、EGC和EGCG結(jié)構(gòu)的差異在于羥基數(shù)量不同和C環(huán)的4’連接的官能團(tuán)不同，由于它們結(jié)構(gòu)的相似性，均顯示出抗癌、抗炎、抗氧化等方面的重要活性^［23］。特別地，EC和EGCG能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞、MAC-T細(xì)胞和大鼠模型中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)^{［3，24-26］}。小鼠上的研究進(jìn)一步揭示了ECG具有抗動脈粥樣硬化的作用^{［12，18］}。本研究進(jìn)一步揭示ECG能有效地抑制MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺組織中LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)（圖1～3），這與Chen等^［13］的研究結(jié)果一致，表明ECG具有抑制乳腺炎癥的作用。

氧化應(yīng)激通過激活NF-κB促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生^［11］。前期研究報(bào)道綠茶兒茶素能夠降低肥胖、血壓、低密度脂蛋白膽固醇以及心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)^［11］，其中EGCG降低缺氧BV2細(xì)胞中COX-2、iNOS和MPO的表達(dá)^［27］。COX-2由組織損傷部位促炎細(xì)胞因子（如IL-1和IL-6）刺激釋放的誘導(dǎo)酶，它催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素E2來刺激疼痛和炎癥的發(fā)生^［28］。iNOS為一氧化氮合酶，被炎性等刺激激活并催化NO的生成，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡^［29］。MPO由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，為氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵的介導(dǎo)因子；MPO活性與中性粒細(xì)胞的數(shù)量成正比，是中性粒細(xì)胞浸潤和促炎因子表達(dá)的衡量指標(biāo)^［30］。因此，這些氧化應(yīng)激指示因子被認(rèn)為是治療炎癥性疾病和癌癥的重要靶點(diǎn)^［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)ECG在體內(nèi)、體外均能抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2、iNOS和MPO的活性（圖1和3），進(jìn)一步暗示ECG在牛乳腺炎的治療中具有抗氧化和抗炎作用。

細(xì)胞焦亡分為經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路和非經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路^［31-33］。相關(guān)研究已證明LPS刺激細(xì)胞后，由caspase-1、GSDMD和NLRP3炎癥小體介導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生非經(jīng)典細(xì)胞焦亡^［31-32］。然而，細(xì)胞的過度或不當(dāng)焦亡導(dǎo)致組織損傷^［33］。本研究的體內(nèi)、體外證據(jù)表明ECG對LPS誘導(dǎo)的焦亡與NLRP3炎性小體及其相關(guān)蛋白水平的的抑制作用（圖6～9）。雖然目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道ECG在細(xì)胞焦亡調(diào)控中的作用，但是前期的研究也表明，EC和EGCG在小鼠肺炎組織、小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞和慢性阻塞性肺病患者中阻止NLRP3炎癥小體和caspase-1的激活^［34-36］；ECG能夠減輕大鼠的炎癥和凋亡^［14］，這些研究報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)了ECG的抗焦亡作用。

NF-κB是各種生物細(xì)胞中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，是LPS誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路^［37-38］。NF-κB在未受到刺激的靜息狀態(tài)下與IκB結(jié)合而失活；當(dāng)LPS等外部刺激出現(xiàn)時(shí)，會導(dǎo)致IκB的磷酸化和隨后的泛素化降解，釋放p65進(jìn)入到細(xì)胞核啟動NLRP3、IL-1β和IL-18等靶基因的轉(zhuǎn)錄^［37-38］。本研究體內(nèi)和體外結(jié)果表明，ECG降低了LPS誘導(dǎo)的p-IκBα和p-p65蛋白水平與細(xì)胞核含量（圖4、5）。前期的研究進(jìn)一步報(bào)道ECG抑制ROS、p-IκB、p-p65和TLR4水平^{［13，18］}；EC能夠降低p-IκB和p-p65水平^［3］。這些證據(jù)充分證明ECG對NF-κB信號通路的抑制作用。

4 結(jié) 論

本研究揭示了ECG可有效減輕LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺炎癥；ECG抑制了MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺組織中LPS誘導(dǎo)的炎性和細(xì)胞焦亡反應(yīng)，并且抑制NF-κB通路以及NLRP3炎癥小體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。今后將進(jìn)一步研究ECG在抗牛乳腺炎更深層次的分子機(jī)制以及在奶牛乳腺炎防治中的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ HU H H， FANG Z， MU T， et al. Application of metabolomics in diagnosis of cow mastitis：a review［J］. Front Vet Sci， 202 8：747519.

［2］ YU S， LIU X， YU D， et al. Morin protects LPS-induced mastitis via inhibiting NLRP3 inflammasome and NF-κB signaling pathways［J］. Inflammation， 2020， 43（4）：1293-1303.

［3］ MA X， LI M M， LU G C， et al. Anti-inflammation of epicatechin mediated by TMEM35A and TMPO in bovine mammary epithelial cell line cells and mouse mammary gland［J］. J Dairy Sci， 202 104（12）：12925-12938.

［4］ LI M M， LU G C， MA X， et al. Anti-inflammation of isoliquiritigenin via the inhibition of NF-κB and MAPK in LPS-stimulated MAC-T cells［J］. BMC Vet Res， 2022， 18（1）：320.

［5］ LI L， WEI X F， YANG Z Y， et al. Alleviative effect of poly-β-hydroxybutyrate on lipopolysaccharide-induced oxidative stress， inflammation and cell apoptosis in Cyprinus carpio［J］. Int J Biol Macromol， 2023， 253：126784.

［6］ MIAO E A， LEAF I A， TREUTING P M， et al. Caspase-1-induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intracellular bacteria［J］. Nat Immunol， 2010， 11（12）：1136-1142.

［7］ JIANG A M， ZHANG Y， ZHANG X， et al. Morin alleviates LPS-induced mastitis by inhibiting the PI3K/AKT， MAPK， NF-κB and NLRP3 signaling pathway and protecting the integrity of blood-milk barrier［J］. Int Immunopharmacol， 2020， 78：105972.

［8］ RUSSO H M， RATHKEY J， BOYD-TRESSLER A， et al. Active caspase-1 induces plasma membrane pores that precede pyroptotic lysis and are blocked by lanthanides［J］. J Immunol， 2016， 197（4）：1353-1367.

［9］ YE Z， LI L Z， LI Y Z， et al. Tou Nong powder obstructs ulcerative colitis through the regulation of NF-κB/NLRP3/Caspase-1/GSDMD inflammasome pyroptotic pathway［J］. J Ethnopharmacol， 2023， 317：116846.

［10］ SAMPATH C， RASHID M R， SANG S M， et al. Green tea epigallocatechin 3-gallate alleviates hyperglycemia and reduces advanced glycation end products via nrf2 pathway in mice with high fat diet-induced obesity［J］. Biomed Pharmacother， 2017， 87：73-81.

［11］ PREZ-TORRES I， CASTREJ N-TLLEZ V， SOTO M E， et al. Oxidative stress， plant natural antioxidants， and obesity［J］. Int J Mol Sci.， 202 22（4）：1786.

［12］ AL-SAYED E， ABDEL-DAIM M M. Analgesic and anti-inflammatory activities of epicatechin gallate from Bauhinia hookeri［J］. Drug Dev Res， 2018， 79（4）：157-164.

［13］ CHEN G J， CHENG K， NIU Y， et al. （-）-Epicatechin gallate prevents inflammatory response in hypoxia-activated microglia and cerebral edema by inhibiting NF-κB signaling［J］. Arch Biochem Biophys， 2022， 729：109393.

［14］ MALIK S， SUCHAL K， BHATIA J.， et al. Molecular mechanisms underlying attenuation of cisplatin-induced acute kidney injury by epicatechin gallate［J］. Lab Invest， 2016， 96（8）：853-861.

［15］ STADLBAUER S， STEINBORN C， KLEMD A， et al. Impact of green tea catechin ECG and its synthesized fluorinated analogue on prostate cancer cells and stimulated immunocompetent cells［J］. Planta Med， 2018， 84（11）：813-819.

［16］ ZHU M， FEI X Y， GONG D M， et al. Effects of processing conditions and simulated digestion in vitro on the antioxidant activity， inhibition of xanthine oxidase and bioaccessibility of epicatechin gallate［J］. Foods， 2023， 12（14）：2807.

［17］ EZHIL I， LAKSHMI T. Antibacterial efficacy of epicatechin and rutin from Acacia catechu leaf extract against Enterococcus faecalis and Streptococcus mutans-an in vitro study［J］. J Adv Pharm Educ Res， 2017， 7（1）：22-24.

［18］ YU J J， LI W F， XIAO X， et al. （-）-Epicatechin gallate blocks the development of atherosclerosis by regulating oxidative stress in vivo and in vitro［J］. Food Funct， 202 12（18）：8715-8727.

［19］ LI W F， YU J J， XIAO X， et al. The inhibitory effect of （-）-epicatechin gallate on the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells weakens and stabilizes atherosclerosis［J］. Eur J Pharmacol， 202 891：173761.

［20］ SADEK K， SALEH E， AYOUB M. Selective， reliable blood and milk bio-markers for diagnosing clinical and subclinical bovine mastitis［J］. Trop Anim Health Prod， 2017， 49（2）：431-437.

［21］ AL-HARBI N O， IMAM F， AL-HARBI M M， et al. Dexamethasone attenuates LPS-induced acute lung injury through inhibition of NF-κB， COX-2， and pro-inflammatory mediators［J］. Immunol Invest， 2016， 45（4）：349-369.

［22］ ESMAEELPANAH E， RAZAVI B M， HASANI F V， et al. Evaluation of epigallocatechin gallate and epicatechin gallate effects on acrylamide-induced neurotoxicity in rats and cytotoxicity in PC 12 cells［J］. Drug Chem Toxicol， 2018， 41（4）：441-448.

［23］ MUSIAL C， KUBAN-JANKOWSKA A， GORSKA-PONIKOWSKA M. Beneficial properties of green tea catechins［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（5）：1744.

［24］ ZHONG Y， CHIOU Y S， PAN M H， et al. Anti-inflammatory activity of lipophilic epigallocatechin gallate （EGCG） derivatives in LPS-stimulated murine macrophages［J］. Food Chem， 2012， 134（2）：742-748.

［25］ PRINCE P D， FISCHERMAN L， TOBLLI J E， et al. LPS-induced renal inflammation is prevented by （-）-epicatechin in rats［J］. Redox Biol， 2017， 11：342-349.

［26］ YANG D J， LIU S C， CHEN Y C， et al. Three pathways assess anti-inflammatory response of epicatechin with lipopolysaccharide-mediated macrophage RAW264. 7 Cells［J］. J Food Biochem， 2015， 39（3）：334-343.

［27］ KIM S R， SEONG K J， KIM W J， et al. Epigallocatechin gallate protects against hypoxia-induced inflammation in microglia via NF-κB suppression and Nrf-2/HO-1 activation［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（7）：4004.

［28］ LEE J A， HA S， CHO E， et al. Resveratrol as a bioenhancer to improve anti-inflammatory activities of apigenin［J］. Nutrients， 2015， 7（11）：9650-9661.

［29］ NICHOLAS C， BATRA S， VARGO M A， et al. Apigenin blocks lipopolysaccharide-induced lethality in vivo and proinflammatory cytokines expression by inactivating NF-κB through the suppression of p65 phosphorylation［J］. J Immunol， 2007， 179（10）：7121-7127.

［30］ ZHANG Z M， LI L， HUANG G X， et al. Embelia Laeta aqueous extract suppresses acute inflammation via decreasing COX-2/iNOS expression and inhibiting NF-κB pathway［J］. J Ethnopharmacol， 202 281：114575.

［31］ YE J Z， ZENG B， ZHONG M Y， et al. Scutellarin inhibits caspase-11 activation and pyroptosis in macrophages via regulating PKA signaling［J］. Acta Pharm Sin B， 202 11（1）：112-126.

［32］ WU Q R， YANG H， ZHANG H D， et al. IP3R2-mediated Ca²⁺ release promotes LPS-induced cardiomyocyte pyroptosis via the activation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway［J］. Cell Death Discov， 2024， 10（1）：91.

［33］ CHURCHILL M J， MITCHELL P S， RAUCH I. Epithelial pyroptosis in host defense［J］. J Mol Biol， 2022， 434（4）：167278.

［34］ SUHAIL M， REHAN M， TARIQUE M， et al. Targeting a transcription factor NF-κB by green tea catechins using in silico and in vitro studies in pancreatic cancer［J］. Front Nutr， 2023， 9：1078642.

［35］ TIAN X， XUE Y S， XIE G G， et al. （-）-Epicatechin ameliorates cigarette smoke-induced lung inflammation via inhibiting ROS/NLRP3 inflammasome pathway in rats with COPD［J］. Toxicol Appl Pharmacol， 202 429：115674.

［36］ ZHANG C， LI X， HU X， et al. Epigallocatechin-3-gallate prevents inflammation and diabetes-induced glucose tolerance through inhibition of NLRP3 inflammasome activation［J］. Int Immunopharmacol， 202 93：107412.

［37］ ZHANG Q， LENARDO M J， BALTIMORE D. 30 years of NF-κB：a blossoming of relevance to human pathobiology［J］. Cell， 2017， 168（1-2）：37-57.

［38］ TANIGUCHI K， KARIN M. NF-κB， inflammation， immunity and cancer： coming of age［J］. Nat Rev Immunol， 2018， 18（5）：309-324.

（編輯 白永平）