氟通過自噬和鐵死亡途徑誘發(fā)肉雞小腸氧化損傷

摘 要： 隨著人類工業(yè)、農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，越來越多的氟化物通過飲水、藥物、農(nóng)藥和殺菌劑進(jìn)入生產(chǎn)生活和環(huán)境中，會(huì)對(duì)生活在相應(yīng)地區(qū)的動(dòng)物產(chǎn)生不利影響。為了探討氟中毒導(dǎo)致肉雞小腸損傷的相關(guān)作用，本研究通過氟化物飲食暴露建立動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。試驗(yàn)按照飼料中氟化鈉暴露劑量水平分為對(duì)照組C（0 mg·kg^-1）、低劑量氟組L（500 mg·kg^-1）、中劑量氟組M（1 000 mg·kg^-1）和高劑量氟組H（2 000 mg·kg^-1），分別處理肉雞6周，分析氟化物暴露對(duì)肉雞小腸的影響。結(jié)果顯示：隨著氟化鈉暴露濃度的增加，Nrf2增加（Plt;0.001），Keap1減少（Plt;0.001），HO-1減少（Plt;0.001），NQO1在高濃度組降低（Plt;0.01），Nrf2/HO-1通路被激活，但其下游抗氧化酶減少，提示發(fā)生了氧化應(yīng)激；p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著升高（Plt;0.001），最后恢復(fù)正常甚至減少（Plt;0.05），而PI3K顯著降低（Plt;0.001），提示PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化被抑制；Beclin-1顯著增加（Plt;0.001），ATG12變化不顯著，LC3蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05），提示自噬體加速形成和自噬流活化，p62蛋白與自噬底物蛋白結(jié)合，含量減少（Plt;0.001），表明自噬通路未受阻。同時(shí)FTH1降低（Plt;0.01），NCOA4升高（Plt;0.01），儲(chǔ)鐵蛋白降解釋放出二價(jià)鐵離子；ASCL4和ALOX12蛋白表達(dá)量升高（Plt;0.01），促進(jìn)脂質(zhì)過氧化過程；SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)量顯著降低（Plt;0.001），細(xì)胞清除脂質(zhì)過氧化物能力降低，易發(fā)生鐵死亡。綜上，氟化鈉會(huì)干擾Nrf2-Keap1抗氧化途徑，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，也會(huì)激活自噬，最終導(dǎo)致肉雞小腸發(fā)生鐵死亡。

關(guān)鍵詞： 氟化鈉；雞；小腸；氧化應(yīng)激；細(xì)胞自噬；鐵死亡

中圖分類號(hào)： S856.9"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0442-13

收稿日期：2024-02-19

基金項(xiàng)目：東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目國家級(jí)（202310225077）；黑龍江省博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（LBH-Z23057）

作者簡介：王 藝（2001-），女，山東煙臺(tái)人，本科，主要從事動(dòng)物中毒病病理學(xué)研究，E-mail： wangyi@nefu.edu.cn

*通信作者：王 雨，主要從事野生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)、動(dòng)物中毒病病理學(xué)、食品安全和公共衛(wèi)生學(xué)研究，E-mail： wangyu2013@nefu.edu.cn

Fluoride Induced Small Intestine Oxidative Damage in Broilers via Autophagy and Ferroptosis

WANG" Yi， HOU" Lulu， FANG" Fei， GAO" Linying， XIE" Shumin， WANG Yu*

（College of Wildlife and Protected Area， Northeast Forestry University， Harbin 150040，" China）

Abstract： "With the continuous development of industrial and agriculture， more and more fluoride enters the production， life and environment through drinking water， medicines， pesticides and fungicides， which may have adverse effects on animals living in the area. In order to explore the related effects of fluoride poisoning on small intestinal injury in broilers， we established an animal experimental model through fluoride diet exposure for subsequent verification. Broilers were divided into control group C （0 mg·kg^-1）， low-dose fluoride group L （500 mg·kg^-1）， medium dose fluoride group M （1 000 mg·kg^-1） and high-dose fluoride group H （2 000 mg·kg^-1） according to the exposure dose level of sodium fluoride in feed. The effects of fluoride exposure on small intestine of broilers were analyzed. With the increase of sodium fluoride exposure concentration， Nrf2 increased （Plt;0.001）， Keap1 decreased （Plt;0.001）， HO-1 decreased （Plt;0.001）， and NQO1 decreased in the high concentration group （Plt;0.01）. The Nrf2/HO-1 pathway was activated， but its downstream antioxidant enzymes decreased， suggesting the oxidative stress may occur; the protein expression of p-AKT and p-mTOR increased significantly （Plt;0.001）， and finally returned to normal or even decreased （Plt;0.05）， while PI3K decreased significantly （Plt;0.001）， suggesting that the phosphorylation of PI3K/Akt/mTOR pathway was inhibited; Beclin-1 was significantly increased （Plt;0.001）， ATG12 was not significantly changed， and LC3 protein was significantly higher than the C group （Plt;0.05）， indicating the autophagosomes formation and autophagy flow were accelerated， p62 protein combined with autophagy substrate protein （Plt;0.001）， and the content decreased， indicating the authay pathway was not blocked. At the same time， FTH1 decreased （Plt;0.01）， NCOA4 increased （Plt;0.01）， and ferrous ions were released from the degradation of ferritin; ASCL4 and ALOX12 protein increased （Plt;0.01）， which promoted the lipid peroxidation process; SLC7A11 and GPX4 protein significantly decreased （Plt;0.001）， and the ability of scavenging lipid peroxide was reduced， which was prone to ferroptosis. Sodium fluoride interfered with the Nrf2 antioxidant pathway， leading to oxidative stress， also activate autophagy and ultimately lead to ferroptosis in the small intestine of broilers.

Key words： sodium fluoride; chicken; small intestine; oxidative stress; autophagy; ferroptosis

*Corresponding author：" WANG Yu， E-mail： wangyu2013@nefu.edu.cn

氟是周期表中最活潑的元素之一，屬于鹵族元素，在自然界中以氟化物的形式存在，如氟化鈣和氟化鈉。同時(shí)，作為一種生物必需的微量元素，氟在骨骼鈣化和牙釉質(zhì)形成的方面發(fā)揮了重要作用，一些地區(qū)將氟化物添加到飲用水中，以減少齲齒的發(fā)生。隨著人類工業(yè)、農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，越來越多的氟化物通過飲水、藥物、農(nóng)藥和殺菌劑進(jìn)入到環(huán)境和人類的生活區(qū)，被污染的水和粗飼料都被認(rèn)為是導(dǎo)致氟中毒的主要因素^［1］。對(duì)東北高氟地區(qū)的居民的飲水檢測(cè)發(fā)現(xiàn)氟含量明顯超標(biāo)，有病人表現(xiàn)出氟斑牙和氟骨癥臨床癥狀，并伴有腰腿疼痛^［2］。氟中毒的靶器官是骨骼和牙齒，正常攝入量的氟（小于1 mg·L^-1）能夠促進(jìn)骨骼和牙齒正常發(fā)育，但長期過量攝入氟（大于1.5 mg·L^-1）可能出現(xiàn)氟斑牙、氟骨癥等氟中毒現(xiàn)象^［3］。在氟化物高度污染的地區(qū)中，每天攝入少量有毒物質(zhì)會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生負(fù)面影響。研究發(fā)現(xiàn)，地方性氟中毒引起綿羊的慢性毒性，涉及骨骼、消化道、肝、腎、神經(jīng)和生殖器官等^［4-6］。同樣的，生活在氟化物污染地區(qū)的動(dòng)物，如牛、駱駝、驢和馬等，在不同程度上均受到氟化物毒性影響^［7］。

氟毒性的研究一直備受關(guān)注，其對(duì)畜牧業(yè)的影響也是。肉雞是滿足人類需求的肉類食品的重要來源，是畜牧業(yè)的重要組成部分，針對(duì)氟所致肉雞毒性作用的研究逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)，高氟日糧暴露引起肉雞貧血，損傷紅細(xì)胞的膜完整性、運(yùn)輸氧氣和二氧化碳的能力以及免疫黏附功能^［8］。血液學(xué)指標(biāo)是動(dòng)物生理、病理和營養(yǎng)狀況的良好標(biāo)志，血液學(xué)參數(shù)的變化有可能用于闡明氟對(duì)肉雞的毒性影響。胃腸道是經(jīng)口毒物最早接觸的器官，也是體內(nèi)最大的免疫器官，其穩(wěn)態(tài)有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度氟暴露會(huì)引起腸道菌群的紊亂，增加有害細(xì)菌^［9］。日糧氟暴露后肉雞小腸中IgA+細(xì)胞的數(shù)量和免疫球蛋白的含量下降，這最終可能影響腸道中的黏膜、體液免疫功能^［10］。氟中毒能夠通過調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma- Bcl-2）家族蛋白激活肉雞盲腸扁桃體淋巴線粒體細(xì)胞凋亡途徑^［11］。小腸是動(dòng)物重要的消化吸收器官，它在禽類養(yǎng)殖中決定了飼料轉(zhuǎn)化率。氟的暴露也會(huì)抑制小腸的發(fā)育，可能損害腸道的正常功能^［12］。同時(shí)，高濃度氟暴露會(huì)引起肉雞小腸氧化應(yīng)激，減少緊密連接蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致十二指腸和空腸的腸黏膜通透性增加，最終降低了肉雞的生長性能^［13］。然而，氟對(duì)肉雞小腸的毒性作用的研究很少，它的作用機(jī)制仍不清楚。

氧化應(yīng)激是氟重要毒性作用之一。過量攝入氟導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體功能障礙^［14］。氟暴露也會(huì)引起肉雞小腸氧化應(yīng)激，抑制NF-E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor" Nrf2）途徑，導(dǎo)致線粒體途徑細(xì)胞凋亡^［15］。Nrf2信號(hào)通路是經(jīng)典的抗氧化防御途徑。在正常生理情況下，Nrf2主要與它的胞質(zhì)接頭蛋白（Kelch-like ECH-associated protein "Keap1）結(jié)合在一起，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。氧化應(yīng)激刺激下Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2活化進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf蛋白結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，二聚體與抗氧化原件結(jié)合，調(diào)控抗氧化酶活性，發(fā)揮抗氧化功能^［16］。而氟的腸毒性與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系仍然未知。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞通過分解和回收自身衰老損傷細(xì)胞器，來維持細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝的平衡，其中最常見的是大自噬^［17］。正常情況下，雷帕霉素（mechanistic target of rapamycin，mTOR）磷酸化UNC-51樣激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase "ULK1）復(fù)合體，抑制下游反應(yīng)。當(dāng)胞內(nèi)外的刺激因子激活ULK1復(fù)合體時(shí)，解除抑制作用，自噬啟動(dòng)。ULK1復(fù)合體與Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白Beclin-1協(xié)同作用于自噬相關(guān)蛋白招募到前自噬體結(jié)構(gòu)，自噬體逐漸延伸和成熟，在自噬體標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated proteins lightchain 3，LC3）作用下開始吞噬損傷細(xì)胞器、大分子等。成熟自噬體與溶酶體發(fā)生融合，形成自噬溶酶體，酸性水解酶降解產(chǎn)生的小分子，如氨基酸，被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，再次用于蛋白質(zhì)的合成^［17］。研究發(fā)現(xiàn)，氟暴露激活I(lǐng)L-17信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠肝臟凋亡和自噬，最終導(dǎo)致肝功能受損^［18］；也可能在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)中通過抑制溶酶體的生物發(fā)生，損害自噬降解途徑^［19］。氟對(duì)肉雞小腸的毒性作用與自噬的關(guān)系尚不清楚。鐵蛋白自噬屬于蛋白質(zhì)介導(dǎo)自噬中的一種，核受體共激活因子4 （nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）與鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain "FTH1）介導(dǎo)鐵蛋白進(jìn)入自噬體，發(fā)生降解、釋放二價(jià)鐵離子，其堆積誘發(fā)鐵死亡^［20］。鐵死亡是一種鐵依賴性細(xì)胞程序性死亡，它的顯著特征是二價(jià)鐵離子堆積、脂質(zhì)活性氧沉積及谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）大量失活^［21-23］。研究發(fā)現(xiàn)，高氟暴露下誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的鐵死亡^［24-25］。而氟中毒所致肉雞小腸的毒性作用與鐵死亡之間關(guān)系仍需繼續(xù)探究。

目前氟中毒對(duì)肉雞小腸毒性的相關(guān)機(jī)制研究較少，而氟中毒與鐵死亡、細(xì)胞自噬存在密切聯(lián)系?；诖?，本研究通過相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)探究氟中毒致肉雞小腸內(nèi)氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和鐵死亡之間的關(guān)系，旨在挖掘其中相關(guān)作用機(jī)制，也為氟的腸毒性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 添加劑和試劑

氟化鈉購自上海市奉賢奉城試劑廠。4%多聚甲醛溶液、聚丙烯酰胺和曝光液購自美國biosharp公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自翌圣生物科技股份有限公司。HiScript II Q RT Super Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。SYBR green熒光定量染料購自瑞士Roche公司。十二烷基硫酸鈉購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。BCA蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液（強(qiáng)）購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司。四甲基乙二胺（TEMED）購自賽默飛世爾科技（中國）公司。PVDF膜購自美國GE公司。

1.2 氟化鈉暴露的肉雞和樣品采集

120只1日齡肉雞購自中國威威有限公司，經(jīng)過1周的適應(yīng)后，隨機(jī)分為4組（每組30只）：對(duì)照組（C）的飼料氟化鈉水平為0 mg·kg^- 低氟組（L）為500 mg·kg^- 中氟組（M）為1 000 mg·kg^- 高氟組（H）為2 000 mg·kg^- 飼喂6周，空腹1 d后，用乙醚麻醉處死試驗(yàn)肉雞，收集小腸組織儲(chǔ)存并用于后續(xù)試驗(yàn)。暴露劑量中“mg·kg^-1”指的是每千克飼料中包含氟化鈉的質(zhì)量。L組暴露劑量的選擇參考GB 13078—2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，肉用仔雞、育雛雞、育成雞配方飼料中氟元素的國家標(biāo)準(zhǔn)限量小于250 mg·kg^- M和H組在L組的暴露劑量上增加暴露劑量。試驗(yàn)期間，肉雞均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度保持在22～25 ℃，濕度保持在55%～60%，12 h光照和黑暗循環(huán)，并且通風(fēng)良好，飼料和飲用水供應(yīng)充足。

1.3 肉雞小腸的組織形態(tài)的光學(xué)觀察

用4%多聚甲醛溶液固定肉雞小腸組織，靜置24 h，流水沖洗后進(jìn)行脫水、透明和包埋處理。石蠟塊在切片機(jī)上切成1 μm厚的切片，使用蘇木精和伊紅（Hamp;E）染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 肉雞小腸的超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

2.5%戊二醛和1%四氧化鋨中固定肉雞小腸組織，2 h后用乙醇和丙酮對(duì)肉雞小腸進(jìn)行梯度脫水，然后包埋在樹脂中，染色使用4%乙酸鈾酰和0.5%檸檬酸鉛。

通過透射電子顯微鏡觀察樣品。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

通過TRIzol方法從液氮冷凍肉雞小腸組織中提取總RNA，并用于后續(xù)試驗(yàn)。通過Bio Spectrometer Basic分光光度計(jì)（Eppendorf， 德國）測(cè)量A 260 nm/A 280 nm的比例，以獲得RNA的濃度和純度。然后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR在儀器ABI-7500（Applied Biosystems，美國）上使用HiScript II Q RT Super Mix試劑盒進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)的體積為10 μL。在National Coalition Building Institute查找基因序列，并使用Primer Premier 5.0軟件（Premier，加拿大）設(shè)計(jì)引物。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用2^-△△Ct方法制備熔解曲線。引物序列如表1所示。

1.6 Western blot檢測(cè)

將小腸組織放入RIPA裂解緩沖液提取組織和細(xì)胞蛋白，總蛋白濃度通過BCA法測(cè)定。蛋白質(zhì)通過12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行解析后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，4 ℃條件下一抗孵育過夜和使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗孵育膜，加曝光液檢測(cè)特異性反應(yīng)產(chǎn)物?？贵w信息表如表2所示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）”展示。本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和制作圖表使用SPSS 20.0.0.0分析軟件和GraphPad 8.0.1軟件。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），使用Tukey HSD 多重比較4組試驗(yàn)之間的顯著性差異水平。所有試驗(yàn)均以95%的置信度進(jìn)行分析，Plt;0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（其中*.Plt;0.05，**.Plt;0.0 ***.Plt;0.00 ns代表差異不顯著Pgt;0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 氟化鈉對(duì)肉雞小腸腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，通過HE染色觀察小腸顯微結(jié)構(gòu)的變化。C組中腸黏膜微絨毛結(jié)構(gòu)正常，呈細(xì)長圓柱形，向腸腔內(nèi)延伸，排列整齊。紅色箭頭指示L和M組中腸黏膜微絨毛數(shù)量，長度、形態(tài)、隱窩深度與C組類似，而高濃度氟處理后，腸黏膜微絨毛稀疏，短小畸形和隱窩深度顯著變淺。

2.2 氟化鈉對(duì)肉雞小腸腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖2結(jié)果顯示，C組線粒體形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)線粒體嵴斷裂和自噬體。L組出現(xiàn)自噬小體，M組線粒體腫脹、部分線粒體嵴斷裂，H組線粒體腫脹、部分線粒體嵴斷裂，并出現(xiàn)大量自噬體。

2.3 氟化鈉對(duì)肉雞小腸抗氧化途徑相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖3 A所示，與C組相比，氟化鈉暴露使血紅素加氧酶1（heme oxygenase "HO-1）的mRNA水平僅在L和M組顯著性增加（Plt;0.001），醌NADH脫氫酶1（recombinant NADH dehydrogenase quinone "NQO1）和Nrf2變化均不顯著。與L組相比，HO-1的mRNA水平僅H組顯著性減少（Plt;0.001），NQO1和Nrf2變化均不顯著。圖3A中mRNA水平變化綜合分析，通過氟化鈉暴露引起雞小腸內(nèi)抗氧化途徑相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平變化推測(cè)抗氧化酶的減少是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激的消耗。

如圖3 C所示，與C組相比，Nrf2的蛋白表達(dá)水平顯著性增加（Plt;0.001），Keap1顯著減少（Plt;0.001），并且呈劑量依賴性，NQO1和HO-1在L組顯著增加（Plt;0.01），M和H組顯著減少（Plt;0.01）。與L組相比，Nrf2的蛋白表達(dá)水平僅M組顯著增加（Plt;0.001）。Keap1、NQO1和HO-1在M和H組顯著減少（Plt;0.01或者Plt;0.001）。由圖3A和C中mRNA和蛋白指標(biāo)的變化發(fā)現(xiàn)，存在趨勢(shì)不同現(xiàn)象，這是因?yàn)閙RNA和蛋白分別代表轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層次，它們發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔，同時(shí)在轉(zhuǎn)錄后，又會(huì)有轉(zhuǎn)錄后加工、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯和翻譯后加工及修飾好幾個(gè)層面。所以從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平并不完全一致。這些結(jié)果提示氟化鈉暴露引起雞小腸內(nèi)抗氧化途徑蛋白水平變化，Nrf2途徑雖然被激活，但其下游的抗氧化酶卻減少，指向氧化應(yīng)激。

2.4 氟化鈉對(duì)肉雞小腸自噬指標(biāo)的影響

如圖4 A所示，與C組相比，氟化鈉暴露使磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的蛋白表達(dá)水平顯著性減少（Plt;0.001），具有劑量依賴性，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-AKT）僅L組顯著性增加（Plt;0.001），H組顯著性減少（Plt;0.05）；LC3僅M和H組顯著增加（Plt;0.05或者Plt;0.01），p-mTOR僅L組顯著性增加（Plt;0.001），Beclin1顯著增加（Plt;0.001），ATG12變化不顯著，p62顯著減少（Plt;0.001）。與L組相比PI3K、p-AKT和p-mTOR在M和H組蛋白均顯著性減少（Plt;0.001），Beclin1、LC3和p62在M和H組蛋白均顯著性增加（Plt;0.05，Plt;0.01或者Plt;0.001）。氟化物鈉暴露引起雞小腸內(nèi)自噬相關(guān)指標(biāo)蛋白水平變化，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

圖4 C所示，與C組相比，氟化鈉暴露組AKT和ATG5的mRNA水平僅L組顯著性減少（Plt;0.05或者Plt;0.001），ATG12僅L組顯著性減少（Plt;0.01），Beclin-1變化不顯著，p62顯著增加（Plt;0.001）。與 L組相比AKT和ATG5的mRNA水平在M和H組顯著性增加（Plt;0.01或者Plt;0.001），ATG12在M和H組顯著性增加（Plt;0.01），Beclin-1和p62變化不顯著，mTOR在M和H組顯著性減少（Plt;0.01）。氟化鈉暴露引起雞小腸內(nèi)自噬相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平變化，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

2.5 氟化鈉對(duì)肉雞小腸鐵死亡指標(biāo)的影響

如圖5 A所示，與C組相比，氟化鈉暴露組花生四烯酸-12-脂加氧酶（arachidonate-12-lipoxygenase，ALOX12）和NCOA4的蛋白水平顯著升高（Plt;0.001），GPX4和FTH1顯著降低（Plt;0.01或者Plt;0.001），且呈劑量依賴性。溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 1 SLC7A11）在M和H組顯著性減少（Plt;0.001）。與L組相比，ALOX12和NCOA4在M和H組顯著性增加（Plt;0.05，Plt;0.01或者Plt;0.001），GPX4、SLC7A11和FTH1顯著性減少（Plt;0.001）。氟化鈉暴露誘導(dǎo)肉雞小腸發(fā)生鐵死亡。

如圖5 C所示，與C組相比，氟化鈉暴露后Achaete-Scute 復(fù)合體同源物 4（achaete-scute complex homolog 4，ASCL4）的mRNA水平顯著增加（Plt;0.001），F(xiàn)TH1則顯著減少（Plt;0.05或者Plt;0.001），并且呈劑量依賴性。SLC7A11僅在L組顯著增加（Plt;0.001），GPX4僅M和H組顯著性減少（Plt;0.01或者Plt;0.001）。與L組相比，ASCL4的mRNA水平在M和H組顯著性增加（Plt;0.01或Plt;0.001），F(xiàn)TH1、GPX4和SLC7A11在M和H組顯著性減少（Plt;0.05，Plt;0.01或者Plt;0.001）。本研究發(fā)現(xiàn)氟化鈉暴露引起雞小腸內(nèi)鐵死亡途徑相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平變化，誘導(dǎo)鐵死亡。

3 討 論

氟中毒是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，長期攝入過量的氟會(huì)對(duì)生物組織和器官造成負(fù)面影響。值得注意的是，氟中毒主要影響牙齒和骨骼等硬組織，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)它也會(huì)影響非骨骼器官。本研究中，氟暴露后肉雞小腸發(fā)生組織病理學(xué)損傷，變化包括腸黏膜微絨毛稀疏，短小畸形和隱窩深度顯著變淺等；超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)線粒體腫脹、部分線粒體嵴斷裂，并出現(xiàn)自噬體。

氟在食品和飲用水中廣泛存在，過量攝入能誘導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中涉及Nrf2途徑的激活^［26-27］。Nrf2途徑是典型的抗氧化防御機(jī)制，在發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，它能調(diào)節(jié)下游的解毒酶HO-1和NQO1的表達(dá)，發(fā)揮生物內(nèi)在的抗氧化作用^［28］。高濃度氟暴露于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤時(shí)也有類似的研究發(fā)現(xiàn)，此時(shí)活性氧積聚，同時(shí)Nrf2途徑被抑制^［29］。本研究中，Nrf2途徑有短暫地激活，其下游HO-1和NQO1隨氟化鈉暴露濃度增加先增加后減少，這提示氟化鈉暴露后肉雞小腸發(fā)生氧化應(yīng)激，激活Nrf2抗氧化途徑，但隨著暴露濃度增加，小腸內(nèi)氧化應(yīng)激程度超過了調(diào)控范圍，抗氧化途徑被抑制，細(xì)胞命運(yùn)可能由存活導(dǎo)向死亡。結(jié)果中Nrf2途徑的變化與先前的研究基本類似。這提示氟暴露誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，Nrf2的變化與氟的暴露濃度有關(guān)。

PI3K-AKT-mTOR是一條自噬經(jīng)典信號(hào)通路，其中mTOR是負(fù)調(diào)控自噬的中樞檢查點(diǎn)，mTOR的抑制刺激自噬^［30］。氟誘導(dǎo)小鼠間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生自噬，主要是通過抑制途徑和激活實(shí)現(xiàn)的^［31］。本研究中氟暴露的小腸中對(duì)PI3K-AKT-mTOR途徑相關(guān)蛋白和mRNA水平的檢查發(fā)現(xiàn)AKT和mTOR的磷酸發(fā)生抑制，這提示自噬被激活，這與先前研究類似。Beclin-1高劑量表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬。LC3也在自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括LC3I、LC3II兩種分子形態(tài)。在自噬發(fā)生時(shí)，LC3會(huì)被剪切成LC3-I型，然后LC3-I型被磷脂酰乙醇胺修飾成LC3-II型，促使自噬體形成和擴(kuò)張過程^［32］。研究表明，LC3-II的量與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)^［33-34］。氟化鈉暴露于肉雞后小腸自噬相關(guān)指標(biāo)Beclin-1、LC3和ATG5顯著增加，這些都指向自噬的發(fā)生。p62是一種自噬底物遞送蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，將p62敲除并不影響會(huì)自噬體的形成，但會(huì)使自噬底物蛋白的募集和降解過程受抑制^［35］。氟化鈉暴露后p62蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，分析發(fā)現(xiàn)是由于自噬流活化，p62與自噬底物蛋白結(jié)合后，進(jìn)入自噬體，經(jīng)歷一系列反應(yīng)后在自噬溶酶體中被降解，所以當(dāng)自噬流活化時(shí)p62蛋白減少^［36］。由上述結(jié)果可知，氟暴露會(huì)引起肉雞心臟中自噬的活化。

氧化應(yīng)激和自噬與鐵死亡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，氟誘導(dǎo)的自噬與鐵死亡之間的串?dāng)_依賴于線粒體活性氧通路^［37］。鐵死亡途徑的一部分依賴自噬，受鐵蛋白自噬調(diào)控，而鐵死亡的相關(guān)蛋白也參與自噬的調(diào)節(jié)^［38］。研究表明，當(dāng)細(xì)胞自噬受抑制時(shí)，鎘暴露導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞中游離鐵水平降低，也即當(dāng)細(xì)胞自噬受抑制時(shí)細(xì)胞鐵死亡也會(huì)受抑制^［39］。鐵蛋白自噬與鐵死亡聯(lián)系緊密，鐵蛋白的自噬降解會(huì)釋放大量的游離鐵，進(jìn)而促進(jìn)鐵死亡^［40］。NCOA4與 FTH1相互作用是介導(dǎo)鐵蛋白自噬降解的關(guān)鍵蛋白。通過下調(diào)NCOA4基因表達(dá)或抑制自噬，可以有效地抑制鐵死亡的發(fā)生^［41-42］。FTH1既可以結(jié)合存儲(chǔ)鐵離子，又可以與NCOA4結(jié)合，分解和釋放游離鐵。解毒酶HO-1也可以通過催化血紅素降解為膽綠素，產(chǎn)生Fe²⁺的積累激活鐵死亡途徑^［43-44］。本試驗(yàn)氟化鈉暴露的肉雞小腸NCOA4蛋白表達(dá)量顯著升高，F(xiàn)TH1顯著降低，發(fā)生鐵自噬，游離鐵離子含量升高，誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。

鐵死亡途徑最核心的變化是脂質(zhì)過氧化，這就涉及到ASCL4和ALOX12涉及的多不飽和脂肪酸的氧化和SLC7A11和GPX4途徑涉及的抵御脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。不飽和脂肪酸會(huì)在ASCL4和溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）的作用下與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成多不飽和脂肪酸的磷脂，后者易受ALOX12介導(dǎo)的自由基引發(fā)的氧化的影響，誘發(fā)鐵死亡^［45］。本研究中氟暴露組肉雞小腸中ASCL4和ALOX12蛋白表達(dá)量升高，脂質(zhì)過氧化物含量升高。胱氨酸經(jīng)嵌于細(xì)胞膜表面的SLC7A11和SLC3A2二聚體進(jìn)入細(xì)胞，然后被氧化成半胱氨酸，最后經(jīng)谷氨酸-半胱氨酸連接酶和GSH合成酶催化合成GSH。GPX4利用GSH能夠?qū)⒅|(zhì)過氧化的過氧鍵（L-OOH）轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基（L-OH），失去其過氧化物的活性，這是清除脂質(zhì)過氧化的主要途徑^［46］。本研究中氟暴露后SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞清除脂質(zhì)過氧化物能力降低，易發(fā)生鐵死亡。綜上數(shù)據(jù)，在本研究中，氟化鈉暴露通過鐵代謝、脂質(zhì)代謝和GSH代謝三條途徑的作用導(dǎo)致了肉雞小腸組織發(fā)生鐵死亡。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)氟中毒導(dǎo)致肉雞小腸組織病理學(xué)損傷，初步確定了氟毒性作用的相關(guān)途徑：即通過氧化應(yīng)激和自噬途徑誘導(dǎo)鐵死亡。本研究結(jié)果為研究環(huán)境中氟化物造成的家禽小腸毒性和損害提供了理論依據(jù)，也為評(píng)價(jià)氟對(duì)家禽毒理損傷的機(jī)理及其對(duì)人體健康的影響提供了重要的參考。

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（編輯 白永平）