豬小腸抗菌肽Cecropin P1對豬呼吸道菌抑菌活性的研究

李倫鋒，魏建超，謝春陽，彭 帥，李蓓蓓，劉 珂，邵東華，邱亞峰，史子學，馬志永

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，長春 130000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3. 上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，上海 201800）

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豬小腸抗菌肽Cecropin P1對豬呼吸道菌抑菌活性的研究

李倫鋒1,2，魏建超2，謝春陽1，彭 帥1，李蓓蓓2，劉 珂2，邵東華2，邱亞峰2，史子學3，馬志永2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，長春 130000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3. 上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，上海 201800）

摘 要：以豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬支氣管敗血波氏桿菌、豬致病性大腸桿菌、化膿性鏈球菌7株豬呼吸道常見菌為實驗菌，檢測豬小腸抗菌肽對常見的豬呼吸道菌的抑菌效果。結(jié)果顯示，豬小腸抗菌肽對這7株呼吸道菌均有不同程度的抑菌作用，對化膿性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用最為明顯，最小抑菌濃度均為49.5 μg/mL，對豬鏈球菌和大腸桿菌也有較為明顯的抑菌活性，而對豬支氣管敗血波氏桿菌的最小抑菌濃度為398 μg/mL。當前在抗生素大量使用導致細菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性的情況下，抗菌肽以其具有抗菌譜廣、無毒、穩(wěn)定性高、不易產(chǎn)生耐藥性且在體內(nèi)無殘留等優(yōu)點，使抗菌肽抑菌活性的研究顯得尤為重要。

關鍵詞：豬小腸抗菌肽；抑菌活性；最小抑菌濃度

抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物體重要的天然免疫介質(zhì)，是動物體吞噬細胞和黏膜上皮細胞的主要殺菌分子，具有抗菌譜廣、無毒、穩(wěn)定性高、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，近年來逐漸被廣大研究者所關注[1,2]。豬呼吸道菌的感染是引起豬呼吸道病綜合征主要途徑之一。胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是豬呼吸道常見的重要致病菌，均可導致或者繼發(fā)于其他病原感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。原發(fā)和繼發(fā)的細菌性呼吸道病是造成豬大量死亡的重要原因，而大多數(shù)呼吸道菌對抗菌藥物已表現(xiàn)出耐藥性[4,5]。因此，探究新型的不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物顯得尤為重要。本研究主要通過檢測抗菌肽對常見豬呼吸道菌的體外抑菌活性，為新型抗菌藥物的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株 畢赤酵母菌由本實驗室保存；實驗菌種：豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、化膿性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌（實驗室分離鑒定的3株菌，編號為1～3）、豬胸膜性肺炎放線桿菌（實驗室分離鑒定的11株菌，編號為1～11）、豬支氣管敗血波氏桿菌和大腸桿菌（EHEC0157030）均由本實驗室分離鑒定保存。

1.2試劑 氨芐青霉素、卡那霉素購自Sigma公司；酵母膏、蛋白胨、右旋葡萄糖、山梨酸醇、生物素、YNB、甲醇、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉分析純購自北京天根生物科技有限公司。碧云天BCA試劑盒購自北京奇虎科技有限公司。

1.3抗菌肽的制備 取畢赤酵母菌接種于4 mL（含100 μg/mL zeocin）的YPDS液體培養(yǎng)基（酵母膏1%、蛋白胨2%、右旋葡萄糖2%、山梨酸醇 18.22%）中，29℃、300r/min搖床過夜取OD600為1的菌種100 μL接種在5 mL BMGY 培養(yǎng)基（1%酵母膏、2%蛋白胨、l%甘油、0.4 mg/L生物素、1.34%YNB、100 mol/L磷酸鹽緩沖液）中，29℃、300 r/min搖床培養(yǎng)24 h，3214×g，離心10 min，將沉淀菌體重懸至25 mL BMMY液體培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇、0.4mg/L生物素、1.34%YNB、100 mol/L磷酸鹽緩沖液）中，29℃、300 r/min搖床培養(yǎng)，每24 h補加0.5%的甲醇，72 h時，12857×g，離心10 min離心收集上清，用0.22 μL濾膜過濾，得到粗制的豬小腸抗菌肽[6]；同時按上述方法培養(yǎng)X33空載體，0.22 μm濾膜過濾得到上清備用。

1.4抑菌活性檢測-瓊脂擴散試驗[7]將實驗菌株均配制成106cfu/mL菌懸液，配制TSA固體培養(yǎng)基（1.5%胰蛋白胨、0.5%大豆蛋白胨、0.5%氯化鈉、1.5%瓊脂糖），高壓冷卻至55℃左右，將菌種和培養(yǎng)基按1:100混合，輕輕晃動至菌種培養(yǎng)基混合均勻后倒入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿，厚度為1.5cm，待凝固后打梅花孔，將抗菌肽、氨芐青霉素（100μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）（陽性對照）以30 μL/孔加至孔中，37℃培養(yǎng)24 h后，通過檢測抑菌圈直徑來確定其抑菌活性。

1.5測定抗菌肽對豬呼吸道菌的抑菌作用

1.5.1檢測抗菌肽濃度 按碧云天BCA試劑盒說明書進行檢測[8]。同時檢測X33空載體表達的上清濃度和抗菌肽濃度，抗菌肽濃度=抗菌上清濃度-X33上清濃度。

1.5.2抗菌肽抗菌活性的檢測。復蘇細菌后按上述1.4的方法進行檢測。

1.5.3抗菌肽對實驗菌株的最小抑菌濃度（微量肉湯稀釋法檢測） 取8支裝有4 mL MH肉湯培養(yǎng)基（牛肉浸粉 5%、酪蛋白水解物 17.5%、淀粉 1.5%）的試管，分別將實驗菌接種到試管中，37℃、180 r/ min，搖床16 h進行細菌增殖。將得到的豬小腸抗菌肽通過0.22 μL濾膜過濾后，依次進行倍比稀釋，共稀釋10個梯度，置于EP管內(nèi)。將稀釋好的抗菌肽各取10 μL加入96孔板中，氨芐青霉素和培養(yǎng)基作為對照。將增殖后的菌液稀釋至5×105CFU/mL，每行一株菌種取90 μL加至96孔板中，混合均勻后放入37℃培養(yǎng)箱中18 h，觀察并記錄實驗結(jié)果，平行重復3次，取平均值[9]。

2　結(jié)果

2.1重組豬小腸抗菌肽的抗菌活性檢測 畢赤酵母表達得到的豬小腸抗菌肽瓊脂擴散結(jié)果顯示：1、2、3孔有明顯的抑菌圈，說明畢赤酵母表達得到的抗菌肽具有較高的生物活性；豬小腸抗菌肽、卡那霉素、氨芐青霉素在劑量等同的條件下具有相對較高的抗菌活性，豬小腸抗菌肽對常見豬呼吸道菌有明顯的抑制或殺滅作用；5、6分別表示X33空載體和畢赤酵母培養(yǎng)基BMMY無抑菌圈，排除了培養(yǎng)基和抗菌肽不純對實驗結(jié)果的影響。

圖1　抗菌肽Cecropin P1抑菌活性檢測Fig. 1 Results on the antibacterial activity of Cecropin P1a: 豬鏈球菌; b: 胸膜性肺炎放線桿菌; c: 豬支氣管敗血波氏桿; d: 化膿性鏈球菌; e: 多殺性巴氏桿菌; f: 金黃色葡萄球菌; g: 大腸桿菌2、3: 卡那霉素、氨芐青霉素; 1、4、7: 豬小腸抗菌肽樣品、樣品稀釋101、樣品稀釋102; 5、6: X33空載體、畢赤酵母培養(yǎng)基BMMYa: Streptococcus suis; b: Actinobacillus pleuropneumoniae; c: Swine bordetella bronchiseptica; d: Streptococcus pyogenes; e: Pasteurella multocida; f: Staphylococcus aureus; g: Swine enteropathogenic E.coli2, 3: The positive control of kanamycine and ampicillin; 1, 4 ,7: Swine intestine's antibacterial peptide, 10 times diluted sample, 100 times diluted sample, respectively; 5, 6: X33 non-carrier and pichia medium BMMG

2.2抗菌譜的測定結(jié)果 瓊脂擴散實驗3次平行結(jié)果顯示：豬小腸抗菌肽對常見豬鏈球菌（Ss）、多殺性巴氏桿菌（Pm）、豬胸膜肺炎放線桿菌（App）、化膿性鏈球菌（Sp）、豬致病性大腸桿菌（EHEC0157030）金黃色葡萄球菌（ATCC29213）等自然分離株均有明顯的殺滅或抑制作用。對豬支氣管敗血波氏桿菌（Bb）的抑菌作用稍弱（表1）。

表1 豬小腸抗菌肽的抗菌譜測定Table 1 Determination of antibacterial spectrum of antibacterial peptides

2.3微量肉湯稀釋法檢測豬小腸抗菌肽對實驗菌株的最小抑菌濃度結(jié)果 通過BCA法檢測畢赤酵母表達得到的粗制豬小腸抗菌肽的濃度為15.935mg/mL，以抗菌肽的初始濃度進行倍比稀釋，微量肉湯稀釋法檢測結(jié)果顯示，豬小腸抗菌肽對化膿性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度相對較低，說明只要較低濃度的抗菌肽就可以殺滅這3株菌，驗證了抗菌肽具有較高的的抑菌或殺菌活性；對豬鏈球菌和大腸桿菌的抑菌效果弱于化膿性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌，但也有較為明顯的抑菌活性；而對豬支氣管敗血波氏桿菌的最小抑菌濃度為389.3 μg/mL，相對較高，說明抗菌肽對豬支氣管敗血波氏桿菌抑菌作用不明顯（表2）。

表2 豬小腸抗菌肽對實驗菌株的最小抑菌濃度Table 2 Minimal inhibitory concentration of porcine small intestinal antibacterial peptides Cp 1 against 7 bacterial

3　討論

抗菌肽的整個發(fā)展過程經(jīng)歷了相當長的一段時間，至今為止人們對其精確的抗菌機理和分子水平方面研究較少，導致其優(yōu)良的特性至今仍無法應用于臨床。近年來人們對抗菌肽的研究越來越重視：一方面，將抗菌肽作為抗菌藥物來代替抗生素，以此來彌補抗生素易產(chǎn)生耐藥性的不足[10]；另一方面，在分子水平上研究其在機體免疫防御系統(tǒng)中的合成過程及其作用機制[11]；其次，抗菌肽的高抗菌活性、無細菌耐藥性及其對正常細胞無傷害的特性，使其具有巨大的藥用價值，抗菌肽成為繼青霉素等傳統(tǒng)抗生素之后的新的抗菌制劑指日可待[12]。另外，抗菌肽在農(nóng)業(yè)領域和作物品種改良方面也有著巨大的應用價值。因此，高活性的抗菌肽的開發(fā)和應用擁有廣闊的空間。

豬小腸抗菌肽在動物體內(nèi)廣泛存在于嗜中性白細胞、粘膜和皮膚等部位，馬衛(wèi)明等[13]研究表明可以從豬小腸的組織中提取得到豬小腸抗菌肽，而動物腸道中有大量的細菌，腸道菌群平衡可以通過腸道內(nèi)膜分泌的內(nèi)源性抗菌肽來進行維持。有實驗研究表明，腸道防御素的表達量可以調(diào)控腸道致病菌的易感性，活性降低，易感性增加。但是豬小腸抗菌肽通過小腸組織提取得到的量比較低，無法進行大規(guī)模的應用。本研究采用基因重組的方法成功的得到具有生物活性的抗菌肽，經(jīng)體外抗菌實驗表明，豬小腸抗菌肽具有較強的抑制豬常見致病菌的效果，表明豬小腸抗菌肽具有一定的維持腸道菌群平衡的能力。

當前在抗生素大量使用導致細菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性，細菌耐藥與控制耐藥，已成為一個全球性的問題[14]。動物被耐藥菌感染后會因抗菌藥物治療無效而增加其死亡率，近年研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性高、而且因其獨特的殺菌機制使其不易產(chǎn)生耐藥性、又能抑殺耐藥菌株，從而為將抗菌肽發(fā)展成為新一代的抗菌藥物提供了研究基礎[15]。本研究結(jié)果顯示抗菌肽對常見的豬呼吸道菌具有較強的殺菌作用，如豬小腸抗菌肽對化膿性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為49.8 μg/mL，較低濃度的抗菌肽就可以殺滅細菌。因此，抗菌肽成為新的抗菌制劑得到廣泛的應用指日可待。

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·研究論文·

RESEARCH ON ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF CECROPIN P1 TO PORCINE RESPIRATORY BACTERIA

LI Lun-feng1,2, WEI Jian-chao2, XIE Chun-yang1, PENG Shuai1, LI Bei-bei2, LIU Ke2, SHAO Dong-hua2, QIU Ya-feng2, SHI Zi-xue3, MA Zhi-yong2

(1. College of Food Science and Technology, Jilin Agricultural University,Changchun 130000, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. Shanghai Jiading District Municipal Agriculture Commission, Shanghai 201800, China)

Key words:Cecropin P1; antibacterial activity; minimum inhibitory concentration

Abstract:Antibacterial peptide cecropin P1 was originally isolated from the small intestines of the pigs. In the present study, the recombinant cecropin P1 produced in pichia pastoris was tested for its antibacterial activity against seven species of common swine respiratory bacteria including Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae, swine Bordetella bronchiseptica, swine enteropathogenic E.coli and Streptococcus pyogenes. The recombinant cecropin P1 showed different degrees of bacteriostasis for these seven respiratory bacteria as measured by MIC (minimal inhibitory concentration). The most signifi cant bacteristasis was observed for Streptococcus pyogenes, Pasteurella multocida and Staphylococcus aureus with MIC of 49.5 ug/mL, andmoderate antibacterial activity for Sreptococcus suis and E.coli. In contrast, the recombinant cecropin P1 had the least bacteriostasis for swine Bordetella bronchiseptica as the MIC was 398 ug/mL. Currently, the vigorous use of antibiotics has caused the bacteria to have developed the high-level resistance. The availability of the recombinant cecropin P1 is of great signifi cance as it possesses wide antimicrobial spectrum, toxin-free nature, high stability, less resistance and no residue in the body.

中圖分類號：S852.616

文獻標志碼：A

文章編號：1674-6422（2016）01-0052-05

收稿日期：2015-11-09

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2014CB542703);上海市科技興農(nóng)重點攻關項目（滬農(nóng)科攻字（2013）第5-6號）

作者簡介：李倫鋒，女，碩士研究生，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程專業(yè)

通信作者：馬志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn；謝春陽，E-mail：xiechunyang@163.com