新疆昌吉部分地區(qū)馬梨形蟲病檢測初報

瓦熱斯·吐爾松，李永暢，朱玉濤，圖爾蓀·薩迪爾，楊紅霞，巴音查汗

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

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新疆昌吉部分地區(qū)馬梨形蟲病檢測初報

瓦熱斯·吐爾松，李永暢，朱玉濤，圖爾蓀·薩迪爾，楊紅霞，巴音查汗

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

摘 要：為了解昌吉養(yǎng)殖馬區(qū)域馬匹感染梨形蟲病情況，本文采用聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)（polymerase chain reaction，PCR）與血液涂片鏡檢法相結(jié)合，對昌吉馬匹隨機(jī)抽樣（n=78），進(jìn)行馬梨形蟲病感染情況調(diào)查。血液涂片結(jié)果顯示，馬泰勒蟲陽性率6.4%，駑巴貝斯蟲陽性率為2.5%；PCR結(jié)果顯示，馬泰勒感染率為28.2%（22/78），駑巴貝斯蟲感染率為10.2%（8/78），混合感染率為10.2%（8/78）。通過對采自馬的蜱進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，共鑒定出4種蜱。該次對昌吉部分地區(qū)馬梨形蟲感染情況的調(diào)查結(jié)果，為該地區(qū)馬的健康發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬梨形蟲?。获R駑巴貝斯蟲；馬泰勒蟲；PCR

馬梨形蟲病是由駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）和馬泰勒蟲（Theileria equi）寄生于馬屬動物的紅細(xì)胞內(nèi)所引起的血液原蟲病，臨床表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疽、出血和呼吸困難等癥狀，若診治不及時，死亡率極高[1]。馬匹感染馬泰勒蟲主要表現(xiàn)為急性和亞急性癥狀，而馬匹感染駑巴貝斯蟲表現(xiàn)為慢性癥狀[2]。馬梨形蟲病危害非常嚴(yán)重，根據(jù)世界衛(wèi)生組（OIE）（2011年）報告，僅2010年全世界有27個國家有馬梨形蟲病的報道，OIE將其列為B類疫病（2008年），我國將其列為二類疫病（1999～02～12）[3]。該病流行的季節(jié)性很強(qiáng)，多零散發(fā)于3～5月，6～8月，并呈急性經(jīng)過，發(fā)病率和死亡率均很高，是制約發(fā)展中國家的馬屬動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。在我國東北、西北、華北等地區(qū)均有感染馬梨形蟲的報道[4]，在新疆流行區(qū)域主要包括伊犁、阿勒泰、塔城以及巴州等大部分地區(qū)。通過對昌吉部分養(yǎng)殖區(qū)域馬梨形蟲病進(jìn)行調(diào)查研究，為當(dāng)?shù)伛R屬動物梨形蟲病的綜合防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1調(diào)查時間和對象 2015年5月，昌吉馬場群養(yǎng)馬匹（n=78）。

1.2樣品來源 對所有被檢馬匹（n=78）進(jìn)行頸靜脈采血，現(xiàn)場進(jìn)行血液涂片、經(jīng)甲醇固定后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行涂片染色，鏡檢。血液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3檢測儀器和試劑 顯微鏡、平衡離心機(jī)、恒溫水浴鍋、凝膠成像分析系統(tǒng)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及電泳槽、PCR儀等。全血DNA提取試劑盒、DNA聚合酶、DNA Marker等試劑均購自上海生物工程有限公司。

1.4顯微鏡檢查方法 應(yīng)用采集樣品時制作的血液涂片，放置到新配制的10%姬姆薩染色液里染色，取出后，使用自來水沖洗，在油鏡下觀察。

1.5DNA提取 使用全血基因組DNA快速抽提試劑盒，進(jìn)行抽提DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6PCR擴(kuò)增 引物由上海生工生物工程有限公司合成。BC48-F：5'-GCGACGTGACTAAG ACCTTATTGG-3'，BC48-R：5'-GTTCTCAAT GTCAGTAG C A T C C G C - 3 '；T E 1 8S - F： 5'-TTTGGGCTGTTTACAGTTGC-3'，TE18S-R：5'-CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG-3'。泰勒蟲18S基因擴(kuò)增體系：10×PCR buffer2.5 μL、TE18S-F/TE18S-R各1 μL、模板2 μL、2×dNTP Mix 12.5 μL、補(bǔ)充滅菌 ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。駑巴貝斯蟲BC48基因擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2.5 μL、BC48-F/BC48-R各1μL、模板2μL、2×dNTP Mix 12.5μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸4 min，10℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，在電泳凝膠成像系統(tǒng)儀中拍照。

1.7蜱的采集和形態(tài) 從被感染蜱的馬匹身上采集了53只蜱，根據(jù)外形和飽血程度分組，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

2　結(jié)果與討論

2.1顯微鏡檢查結(jié)果 血液涂片經(jīng)油鏡觀察發(fā)現(xiàn)，78份樣品中，馬泰勒蟲陽性率為6.4%（5/78），駑巴貝斯蟲陽性率為2.5%（2/78）。

2.2馬駑巴貝斯病和馬泰勒病的PCR檢測結(jié)果 對78份血樣提取DNA，以其作為模板進(jìn)行馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲PCR。泰勒蟲條帶大小為539bp，駑巴貝斯蟲條帶大小為452bp。其中部分血樣PCR鑒定結(jié)果見圖1和圖2。

圖1　馬駑巴貝斯蟲Bc48基因PCR檢測結(jié)果Fig. 1 PCR detection for Babesia caballo in EquineM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～24: 樣品M: DNA Marker(DL2000); 1-24: Samples

圖2　馬泰勒蟲18S rRNA基因PCR檢測結(jié)果Fig. 2 PCR detection for Theileria equi in EquineM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～24: 樣品M: DNA Marker(DL2000); 1-24: Samples

2.2.1昌吉部分地區(qū)馬梨形蟲病感染情況 采自于昌吉78份全血樣品進(jìn)行PCR試驗(yàn)，其結(jié)果顯示馬泰勒感染率為27.5%，駑巴貝斯蟲狀況感染率為10.2%，混合感染率為10.2%；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬梨形蟲病在昌吉感染較為嚴(yán)重。詳見表1。

表1 昌吉馬場馬梨形蟲病感染情況Table 1 PCR detection for Equine piroplasmosis

2.2.2不同年齡馬梨形蟲病感染 本次調(diào)查中，將不同年齡的馬分為1～4年齡、5～9年齡和10歲以上三個組進(jìn)行分析，從結(jié)果來看，5～9年齡段感染率最高，1～4年齡和10歲以上年齡段無太大差別，但是隨年齡的增長，感染率降低。詳見表2。

表2 不同年齡段馬梨形蟲病感染情況Table 2 Piroplasmosis infection situation of Different age Equine

2.3蜱形態(tài)學(xué)鑒定 在調(diào)查過程中檢查了每一匹馬，發(fā)現(xiàn)25（32%）匹馬被蜱感染，采集了53只（雄蟲23只，雌蟲30只）。結(jié)果顯示，小亞璃眼蜱（Hyalomma.anatolicum anatolicum）感染率為7.6%（6／78），草原革蜱（Dermacentor nuttalli）感染率為10.2%（8／78），森林革蜱（Dermacentor siluarum）感染率為6.4%（5／78），邊緣革蜱（Dermacentor marginatus）感染率為7.6%（6／78）。詳見表3。

表3 蜱蟲鑒定結(jié)果和感染率Table 3 Result of Ticks identifi cation and infection

2.4馬梨形蟲病是馬屬動物一種傳播快、危害嚴(yán)重的蜱傳播性血液原蟲病，嚴(yán)重影響?zhàn)B馬業(yè)和馬術(shù)比賽的發(fā)展，世界上許多發(fā)達(dá)國家都十分重視馬病的防控工作[5]。新疆是我國主要的產(chǎn)馬區(qū)，昌吉居全疆前列。為昌吉馬產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，開展馬梨形蟲病流行學(xué)調(diào)查時養(yǎng)馬業(yè)疫病防控的重中之重。

血液涂片是最簡單和方便的診斷方法，為減少診斷誤差，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了鏡檢和PCR檢測方法[6]。此次實(shí)驗(yàn)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血液涂片的檢測結(jié)果中馬泰勒蟲陽性率為6.4%（5/78），駑巴貝斯蟲陽性率為2.5%（2/78）。通過PCR檢測馬泰勒蟲感染率為28.2%（22/78），馬駑巴貝斯蟲的感染率為10.2% （8/78），混合感染率為10.2%（8/78）。經(jīng)血液涂片得到的陽性樣品，均在PCR檢測中被發(fā)現(xiàn)且感染蟲種一致。上述兩種檢測結(jié)果顯示，馬泰勒蟲感染較嚴(yán)重。按不同年齡分組分別進(jìn)行比較，5～9歲馬感染率較高，同時發(fā)現(xiàn)各種年齡段的馬均可感染該病。由此可見，馬泰勒蟲和駑馬貝斯蟲在昌吉馬匹中普遍存在。

馬梨形蟲病的發(fā)生和流行規(guī)律主要與各種蜱的地區(qū)性分布有關(guān)。梨形蟲在蜱體內(nèi)可繼代傳遞，病馬、帶蟲馬和帶蟲蜱均為傳染源[6]。昌吉的自然地理位置獨(dú)特，植被類型多樣，高山、草場、平原、沙漠均適合各種蜱的孳生。本次調(diào)查過程中采集了一定數(shù)量的蜱，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定有森林革蜱、草原革蜱、邊緣革蜱和小亞璃眼蜱。進(jìn)一步確定了馬梨形蟲病流行的自然因素。

參考文獻(xiàn)

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·綜述·

A PRELIMINARY SURVEY OF EQUINE PIROPLASMOSIS IN PART AREA OF CHANGJI, XINJIANG

Waris.Tursun, LI Yong-chang, ZHU yu-tao, Tursun.Sadir, YANG hong-xia, Bayinchahan

(Xinjiang Agricultural University School of Medicine, Urumqi 830052, China)

Key words:Piroplasmosis; Babesia equi; Babesia caballi; PCR

Abstract:In order to understand status of equine piroplasmosis in the breeding horse population in Changji area blood smears were collected from randomly selected 78 horses and examined under microscopy and PCR. As a result, positive rates in blood smears were 6.4% for Theileria equi and 2.5% for Babesia caballi. The higher positive rates were obtained using PCR method. Theileria equi was positive in 22 horses (28.2%), Babesia caballi in 8 horses (10.2%), and mixed infection in 8 horses (10.2%). In addition, four species of ticks were identifi ed and the prevalence of adult ticks was determined.

中圖分類號：S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1674-6422（2016）01-0075-05

收稿日期：2015-11-30

基金項(xiàng)目：國家自然基金-NSFC-新疆聯(lián)合基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：U1170301）

作者簡介：瓦熱斯·吐爾松，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

通信作者：巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com